Circular RNAs (circRNAs) wurden erstmals 1979 als nicht kodierende RNAs entdeckt; erst 2015 wurden transkribierte circRNAs in der Fruchtfliege gefunden, was zur Untersuchung von circRNAs im Reagenzglas zu therapeutischen und präventiven Zwecken führte.
circRNAs expandieren sich selbst und haben daher keine konventionelle Struktur wie einen 5'-Kappen oder einen 3'-Poly-A-Schweif. Diese Struktur macht sie stabiler und widerstandsfähiger gegenüber Exonucleasen wie RNase R.
Strukturelemente des Circular RNA (circRNA)
Die Vorlagendna für die circRNA-Synthese umfasst typischerweise einen internen Ribosomen-Eintritts-Punkt (IRES), einen offenen Leserahmen (ORF) und andere Elemente, die für die in vitro-Zirkulation entscheidend sind. Zum Beispiel haben wir ein Plasmid als Vorlage für die in vitro-Transkription (IVT) entwickelt, das Homologieberge, 3'-Intron, 3'-Exon, IRES, ORF, 5'-Exon und 5'-Intron enthält, um circRNA mittels Selbstsplicing-Methoden herzustellen.
Das interne Ribosomen-Eintritts-Signal (IRES) übernimmt wichtige Funktionen bei der Translation von cirRNAs. Das IRES des Encephalomyocarditis-Virus (EMCV), das IRES des Coxsackievirus B3 (CVB3), das IRES des menschlichen Rhinovirus B3 (HRV-B3) und andere IRES werden häufig für die Translation der in vitro Synthese von cirRNAs verwendet.
Die in vivo Zyclisierung von circRNA-linearen Vorläufern stellt einen wichtigen Schritt in der circRNA-Synthese dar, normalerweise durch chemische, enzymatische und ribosom-vermittelte Selbstreplikationswege. Als Meilenstein auf diesem Gebiet bekannten sich die chemischen Methoden zur circRNA-Produktion, die 1988 entwickelt wurden, heute jedoch wegen ihrer hohen Kosten, geringen Ausbeute, hoher Anzahl an Nebenprodukten und der Tatsache, dass sie nur für die Zyclisierung von RNAs bis zu 70 Nukleotiden Länge geeignet sind, nicht mehr ein.
Enzymatische Methoden zur Cyclisierung von RNA basieren auf Bacteriophagen-T4-Enzymen oder Ribosomen wie T4 DNA Ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA Ligase 1 (T4 Rnl 1) und T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl 2). Um zirkuläre RNA mit T4-Bacteriophagen-Enzymen zu bilden, müssen Nukleosidmonophosphate am 5'-Ende und an die OH-Gruppe am 3'-Ende der RNA gebunden sein. Da während der Reaktion Nukleosidtriphosphate hinzugefügt werden, enthält IVT-RNA Guanosintriphosphat (GTP) am 5’-Ende.
Ribosomen sind RNA-Sequenzen, die selbstständiges Splicing fördern, indem lineare RNA-Moleküle in circRNA umgewandelt werden, ohne dass zusätzliche Enzyme benötigt werden. Der Selbstversammlungsprozess umfasst zwei aufeinanderfolgende Transesterifikationsreaktionen an spezifischen Stellen, um sicherzustellen, dass die gewünschten cirRNA-Produkte entstehen. Die Gruppe-I-Intron-Selbstsplicing-Methode, auch als PIE (Intron- und Exon-Einkapselung) bekannt, die es ermöglicht, cirRNAs länger als 5 kb herzustellen, wurde ausführlich untersucht und hat sich als nützlich erwiesen.
Anwendung von zirkulärem RNA (circRNA)
CircRNA-Impfstoffe
Wie lineare mRNA können circRNA in Zielzellen in bestimmte Proteine umgewandelt werden und eine starke humorale und zelluläre Immunantwort auslösen. Kürzlich haben einige Forschungsteams erfolgreich circRNA-Impfstoffe entwickelt, um COVID-19 zu verhindern. Ihre Ergebnisse verfügten nicht nur über die Vorteile linearer mRNA-Impfstoffe, sondern zeigten auch eine bessere Stabilität und eine längere Dauer des Proteinausdrucks im Vergleich zur linearen mRNA. Daher können circRNA-Impfstoffe ausreichende Immunschutzreaktionen sogar bei niedrigen Dosen induzieren.
Darüber hinaus glauben einige Forscher, dass circRNA-Impfstoffe als nächste Generation von mRNA in der Zukunft effektive Werkzeuge sein könnten, um häufige virale/bakterielle Erkrankungen und wichtige neu auftretende Infektionskrankheiten zu bekämpfen sowie für die Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten eingesetzt zu werden.
CircRNA in CAR/TCR-T-Therapie
Als Pionier auf dem Gebiet der zirkulären RNA entwickelt ORNA eine in situ chimerische Antigenrezeptor (CAR) Therapie für die in situ Therapie, die mit ORN-101, einer LNP-eingekapselten zirkulären RNA, arbeitet, um Immunzellen bei Patienten zu modulieren. ORN-101 zeigt eine hohe Expression des CAR, getrieben von einem optimierten IRES-Element. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass ORN-101 Tumorsuppression und -zerstörung induziert, was darauf hinweist, dass ORN-101-basierte Krebs-Therapien möglicherweise mit konventioneller CAR-T-Zelltherapie interferieren könnten.
Zusätzlich bewerteten Zhang et al. die Lebendigkeit und therapeutische Wirksamkeit von circRNAs in antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR)-T-Therapien. Sie entwarfen eine circRNA, die pp65-TCR-T kodiert, das auf das pp65-Epitop des Cytomegalovirus (CMV) abzielt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass pp65-TCR über 7 Tage auf primären T-Zellen exprimiert wird. Außerdem töteten circRNA-pp65-TCR-T-Zellen spezifisch und konsistent Tumorzellen ab, die pp65 und HLA exprimieren, und verlängerten signifikant die Lebensdauer von Mäusen.
Es wurde außerdem gezeigt, dass Zellen, die mit pp65 circRNA transfiziert wurden, bessere Immunantworten aufwiesen als lineare mRNA.
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