Benutzerdefinierte saRNA-Synthese
Selbstverstärkendes mRNA (saRNA), auch bekannt als Replicon-RNA, kodiert für in vitro Transkription (IVT) mRNA-Sequenzen und virale Replikase-Gene, die von Alphaviren oder Flavivirus abgeleitet sind. Die viralen Replikase-Gene ermöglichen die Selbstverstärkung des mRNA, was zu einer erhöhten Proteinausdrucksrate und einer minimalen erforderlichen RNA-Dosis im Vergleich zu nicht verstärkenden mRNA führt. Ein weiterer Aspekt ist, dass saRNA eine relativ große Molekülstruktur aufweist (mehr als 14 kb).
Yaohai Bio-Pharma hat eine Reihe von mRNA-Synthesetechnologien entwickelt, um nicht-verstärkendes mRNA und selbstverstärkendes mRNA (1000 nt~14000 nt) bereitzustellen, wie Sequenzdesign und -optimierung, IVT, Reinformung, Lyophilisierung und Lipidnanopartikel-(LNP)-Kapselierung. Alle Produkte werden unter strengen Qualitätskontrollstandards freigegeben.
Abb.1 Strukturelle Merkmale von IVT-mRNAs: Konventionell, Zirkulär und Selbstverstärkendes mRNA.
Sequenzenmerkmale von Selbstverstärkendem mRNA
Die selbstverstärkende RNA umfasst vier nicht-strukturelle Proteine (bezeichnet als nsP1, nsP2, nsP3 und nsP4), die von Alphaviren abstammen, spezifisch dem venezolanischen äquinen Enzephalitis-Virus (VEEV). Unter diesen zeigt nsP1 zwei enzymatische Aktivitäten, nämlich GTase und N7MTase, während nsP2 RTPase-Aktivität aufweist, was entscheidend für das Kapieren der IVT-mRNA zur Generierung der Cap-0-Struktur ist. Zudem dient nsP2 als Protease und Helikase, was die komplexe Verarbeitung des gesamten nsP-Komplexes erleichtert. Die genaue Funktion von nsP3 bleibt unklar, es interagiert jedoch mit verschiedenen Wirtezellenproteinen, wodurch es zur Abschwächung der antiviralen Reaktion des Wirts beiträgt.
Ein alphavirus-subgenomischer Promotor (SGP)-Bereich befindet sich vor dem Interessengen (GOI). Das SGP-Element ermöglicht den Beginn der GOI-Transkription, indem es das Lesen der Sequenz, die virale nsP-Proteine kodiert, umgeht.
Abb.2 Synthese und Zelltests von eGFP saRNA der Yaohai Bio-Pharma RNASci Plattform.
Maßgeschneiderte Lösungen für saRNA
Das Syntheseprotokoll von saRNA ist ähnlich zu mRNA: Angepasste mRNA-Synthese
- Sequenzdesign
- Plasmid-Vorlagevorbereitung
- in vitro Transkription (IVT)
- enzymatische mRNA-Kappenbildung
- kovalente mRNA-Capping-während-der-Transkription
- mRNA-Reinigung
- mRNA-Lyophilisierung
- LNP-Kapselung
- Analyse und Test
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