Zirkuläre RNAs (circRNAs) wurden erstmals 1979 als nichtkodierende RNAs entdeckt; Erst 2015 wurden transkribierte circRNAs in Drosophila gefunden, was zur Untersuchung von In-vitro-circRNAs für therapeutische und präventive Zwecke führte.
circRNAs sind selbstexpandierend und haben daher keine konventionelle Struktur wie eine 5'-Kappe oder einen 3'-PolyA-Schwanz. Diese Struktur macht sie stabiler und resistenter gegen Exonukleasen wie RNase R.
Strukturelemente der zirkulären RNA (circRNA)
Die Matrizen-DNA für die circRNA-Synthese umfasst typischerweise die interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), den offenen Leserahmen (ORF) und andere, die für die In-vitro-Zirkulation von entscheidender Bedeutung sind. Beispielsweise haben wir ein Plasmid als In-vitro-Transkript-(IVT)-Template entworfen, das aus Homologiearmen, 3'-Intron, 3'-Exon, IRES, ORF, 5'-Exon und 5'-Intron besteht, um circRNA durch Selbstspleißen herzustellen Methoden.
Die Internal Ribosome Entry Site (IRES) spielt eine wichtige Rolle bei der Übersetzung von cirRNAs. Enzephalomyokarditis-Virus (EMCV) IRES, Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, humanes Rhinovirus B3 (HRV-B3) IRES und andere IRES wurden häufig für die Translation der vitro-Synthese von cirRNAs verwendet
Die In-vivo-Zyklisierung linearer circRNA-Vorläufer stellt einen wichtigen Schritt in der circRNA-Synthese dar, üblicherweise über chemische, enzymatische und Ribosomen-vermittelte Selbstreplikationswege. Der als Meilenstein auf diesem Gebiet bekannte chemische Ansatz zur circRNA-Produktion stammt aus dem Jahr 1988 und wird heute aufgrund der hohen Kosten, der geringen Ausbeute, der hohen Anzahl an Nebenprodukten und der Tatsache, dass er nur zur Zyklisierung geeignet ist, nicht mehr verwendet RNAs mit einer Länge von bis zu 70 Nukleotiden.
Enzymatische Methoden zur Zyklisierung von RNA basieren auf Bakteriophagen-T4-Enzymen oder Ribozymen wie T4-DNA-Ligase (T4 Dnl 1), T4-RNA-Ligase 1 (T4 Rnl 1) und T4-RNA-Ligase 2 (T4 Rnl 2). Um zirkuläre RNA durch T4-Bakteriophagenenzyme zu bilden, müssen Nukleosidmonophosphate am 5'-Ende lokalisiert und an die OH-Gruppe am 3'-Ende der RNA konjugiert sein. Da während der Reaktion Nukleosidtriphosphate hinzugefügt werden, enthält IVT-RNA am 5'-Ende Guanosintriphosphat (GTP).
Ribozyme sind RNA-Sequenzen, die das Selbstspleißen fördern, indem sie lineare RNA-Moleküle in circRNA umwandeln, ohne dass zusätzliche Enzyme erforderlich sind. Der Selbstorganisationsprozess umfasst zwei aufeinanderfolgende Umesterungsreaktionen an bestimmten Stellen, um sicherzustellen, dass die gewünschten cirRNA-Produkte gebildet werden. Die selbstspleißende Methode des Introns der Gruppe I, auch bekannt als PIE (Intron and Exon Encapsulation), die die Produktion von cirRNAs mit einer Länge von mehr als 5 kb ermöglicht, wurde ausführlich untersucht und hat sich als nützlich erwiesen.
Anwendung von zirkulärer RNA (circRNA)
CircRNA-Impfstoffe
Wie lineare mRNAs können circRNAs in Zielzellen in bestimmte Proteine umgewandelt werden und eine robuste humorale und zelluläre Immunität induzieren. In jüngster Zeit haben einige Forschungsteams erfolgreich circRNA-Impfstoffe zur Vorbeugung von COVID-19 entwickelt. Ihre Ergebnisse weisen nicht nur die Vorteile linearer mRNA-Impfstoffe auf, sondern weisen auch eine bessere Stabilität und längere Dauer der Proteinexpression als lineare mRNA auf. Daher können circRNA-Impfstoffe bereits bei niedrigen Dosen ausreichende Immunantworten auslösen.
Darüber hinaus glauben einige Forscher, dass circRNA-Impfstoffe als mRNAs der nächsten Generation in Zukunft zu wirksamen Instrumenten zur Bekämpfung häufiger viraler/bakterieller Erkrankungen und schwerwiegender neu auftretender Infektionskrankheiten sowie zur Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten werden könnten.
CircRNA in der CAR/TCR-T-Therapie
Als Pionier auf dem Gebiet der zirkulären RNA hat ORNA eine In-situ-Therapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) für eine In-situ-Therapie entwickelt, die ORN-101, eine LNP-verkapselte zirkuläre RNA, nutzt, um Immunzellen bei Patienten zu modulieren. ORN-101 bietet eine hohe Ausprägung des CAR, angetrieben durch ein optimiertes IRES-Element. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass ORN-101 die Unterdrückung und Zerstörung von Tumoren induziert, was darauf hindeutet, dass ORN-101-basierte Krebstherapien die herkömmliche CAR-T-Zelltherapie beeinträchtigen könnten.
Darüber hinaus haben Zhang et al. untersuchten die Lebensfähigkeit und therapeutische Wirksamkeit von circRNAs in Antigen-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR)-T-Therapien. Sie entwarfen eine circRNA, die für pp65-TCR-T kodiert und auf das pp65-Epitop des Cytomegalievirus (CMV) abzielt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass pp65-TCR über 7 Tage lang auf primären T-Zellen exprimiert wird. Darüber hinaus töteten circRNA-pp65-TCR-T-Zellen pp65- und HLA-exprimierende Tumorzellen gezielt und konsistent ab und verlängerten die Überlebenszeit von Mäusen erheblich.
Es wurde auch gezeigt, dass mit pp65-circRNA transfizierte Zellen im Vergleich zu linearer mRNA bessere Immunantworten zeigten.
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