In-vitro-Synthese von mRNA
Die Hauptbestandteile der mRNA sind das 5’-Cap, die 5’-UTR, der offene Leserahmen (ORF), die 3’-UTR und der poly-A-Schweif, die für die Aufrechterhaltung der mRNA-Funktion essenziell sind. Forscher haben eine Vielzahl von Methoden zur Identifizierung und Optimierung von mRNA-Sequenzen und -Strukturen verwendet.
Die Synthese von mRNA erfolgt auf der Basis von in-vitro-Transkription (IVT) unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen, RNA-Polymerasen (T3, T7 oder SP6), unmodifizierter oder modifizierter Nukleotide, Enzyme und geeigneter Reagenzien.
5’ Cap Modifikation
Die Sequenzen des reifen mRNA aus dem Eukaryotenzell zeigen eine 7-Methylguanosin-(m7G)-Kappe am 5'-Ende, die die Stabilität der mRNA und die Übersetzungs-effizienz verbessert. Es gibt zwei allgemeine Methoden zur In-vitro-Kaptur von mRNA. Erstens kann mRNA zusammen mit dem In-vitro-Transkript durch Hinzufügen eines Kapanalogons der m7GpppG-Struktur (z. B. CleanCap) zum IVT-System kapsiert werden. Diese ko-transkriptionelle Kappierungsmethode bietet eine natürliche 5'-Kappenstruktur und erhöht die Kappierungs-effizienz auf nahezu 90-99 %. Zweitens kann auch die mRNA-Kartierung durch Enzymreaktionen nach der In-vitro-Transkriptionsreaktion erfolgen.
PolyA Modifikation
Das Poly(A)-Ende verlängert außerdem die Halbwertszeit von mRNA in vivo und verbessert die Übersetzungs-effizienz der mRNA. Die Länge des amplifizierten Poly(A)-Endes sollte zwischen 100-300 Nukleotiden liegen. Zudem erhöht modifiziertes Adenosin die Stabilität des Poly-A-Endes gegen Abbau durch zelluläre RNasen. Das Poly-A-Ende kann mittels in vitro Transkription unter Verwendung eines DNS-Templates mit einem Poly-A-Codierbereich eingefügt werden, was zu einer bestimmten Länge des Poly-A-Endes führt. Eine rekombinante Poly-A-Polymerase kann ebenfalls nach der mRNA-Transkription enzymatisch zur Polyadenylierung verwendet werden.
Nukleotide Modifikation
Modifizierte Nukleoside können die Erkennung und/oder Aktivierung von Mustererkennungsrezeptoren (PRR) hemmen und die Wirksamkeit von mRNA-Impfstoffen auf zwei völlig verschiedene Arten erhöhen. Die Zusatzbestimmung bestimmter chemisch modifizierter Nukleoside, einschließlich Pseudouridin (ψ), 1-Methylpseudouridin (m1ψ), Thiouridin (s4U) und 5-Methylcytosin (m5C), kann die Aktivierung von TLR7/8 und anderen angeborenen Immunrezeptoren verhindern, was die Immunogenität von mRNA erheblich reduziert.
mRNA-Lieferungssystem
Um die Funktion von mRNA aufrechtzuerhalten, muss sie in den Zyttoplasm der Wirtszelle eindringen und spezifische Antigene ausdrücken. Eine der größten Herausforderungen bei mRNA-Impfstoffen und -Therapien besteht darin, mRNA mit ausreichend hohen Übersetzungsleveln in Zielzellen zu liefern, wofür äußerst spezifische und effiziente mRNA-Lieferungssysteme benötigt werden. Mehrere mRNA-Lieferungsvektoren wurden entwickelt und eingesetzt, darunter Dendritische Zellen (DCs), Protamin, kationische Polymere und kationische Liposomen.
Komplexe aus cationischen Lipiden mit mRNA und anderen Präparaten können gemeinsam 80-200 nm große Nanopartikel bilden, die lipidbasierte Nanopartikel (LNPs) genannt werden. Als eines der fortschrittlichsten mRNA-Lieferungssysteme enthält LNP ionisierbare cationische Lipide, natürliche Phospholipide, Cholesterin und Polyethylen Glykol (PEG). Mehrere von der US-Food-and-Drug-Administration genehmigte RNA-Impfstoffe und -Therapien (siRNA und mRNA) basieren auf LNP-Lieferungssystemen.
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Maßgeschneiderte Liefergegenstände
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Wirkstoff, mRNA
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0,1~10 mg (mRNA)
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Präklinische Forschung wie Zelltransfektion, Entwicklung analytischer Methoden, Vorstabilitätstudien, Formulierungsentwicklung
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Arzneimittelprodukt, LNP-mRNA
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GMP, Sterilität
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Wirkstoff, mRNA
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10 mg~70 g
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Investigational new drug (IND), Klinische Studienbewilligung (CTA), Versorgung für klinische Studien, Biologische Lizenzantrag (BLA), Kommerzielle Versorgung
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Arzneimittelprodukt, LNP-mRNA
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5000 Flaschen oder Fertigspritzen/ Kartridjes
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