Enzima Ricombinante per Uso Terapeutico
Gli enzimi terapeutici ottenuti attraverso processi biotecnologici vengono utilizzati ampiamente per diverse applicazioni cliniche, inclusa la terapia di sostituzione enzimatica, la degradazione di metaboliti accumulati e tossine, il trattamento del cancro e la modifica del genoma. Diversi enzimi terapeutici possono essere prodotti in sistemi di espressione microbica.
Enzima ricombinante come materiale
Esistono diversi enzimi utilizzati nella produzione di RNA a lunga codifica (ad es., mRNA, saRNA, circRNA), produzione di coniugati anticorpo-druga (ADCs) e altri. Gli enzimi prodotti da microbi sono più convenienti rispetto a quelli prodotti da cellule mammaliane, in particolare il sistema di espressione E. coli.
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APPLICAZIONE
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Enzimi
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Funzione
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Enzimi per la produzione di RNA lineare, privi di RNasi
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Endonucleasi di restrizione
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Linearizzazione del DNA plasmidico (pDNA) per evitare la generazione di trascritti più lunghi.
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T7 RNA polimerasi (T7 RNAP)
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Legarsi al promotore T7 e generare trascritti RNA specifici; Giocano un ruolo chiave durante la reazione in vitro di trascrizione (IVT).
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Enzima di cappatura della vaccinia
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Aggiungere strutture di Cap alle estremità 5′ degli mRNA IVT.
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Pirofosfatasi, inorganica (iPPase)
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Prevenire la formazione di pirofosfato durante la reazione IVT.
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Inibitore di RNase, ricombinante
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Inibire l'attività di RNase durante la reazione IVT.
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DNase I
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Rimuovi il template DNA.
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Enzima per la produzione di circRNA, privo di RNasi
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Rnase R
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Digerisci l'RNA lineare e arricchisci l'RNA circolare.
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Coniugazione glicidica mediata da enzimi
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Peptidasi N-glicosidica (PNGase F)
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Scinde il legame ammide tra il primo saccharide GlcNAc e il gruppo laterale Asn297; Rilascia glicani dagli anticorpi IgG.
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Transglutaminasi batterica (BTG)
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Coniuga carichi site-specificamente per generare ADC.
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Sortasi A
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Catalizza la ligazione delle proteine.
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β1,4-galattosidasi
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Rilascia tutti i galattosio terminali e forma un isoforma omogenea G0 dell'anticorpo.
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β1,4-galattosiltransferasi (Gal-T)
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Trasferisci un residuo zuccherino con un gruppo funzionale reattivo a livello chimico.
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α2,6-sialiltransferasi (Sial T)
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Incorpora residui di acido siarico terminali nella struttura glicanica nativa di un anticorpo.
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Remodellamento glicanico mediato da enzimi e ingegneria glicosa
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Endo-N-acetilglucosaminidasi (ENGase)
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Idrolizza il legame β1,4-glicosidico tra GlcNAcβ1–4GlcNAc dei glicani N-legati; Rimuovi i glicani N-legati nella regione Fc degli anticorpi IgG.
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Endoglicosidasi S (EndoS)
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Glicosiltransferasi (GTs)
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Trasferiscono l'ossazolina N-glicano agli IgGs defucosilati.
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Altri
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Enzimi prodotti dalla ceppa microbica
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Necessità personalizzata
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Enzima Ricombinante come Reagente
Proteasi per la Rimozione dei Tag
I tag di fusione vengono spesso utilizzati per migliorare la solubilità e la stabilità delle proteine ricombinanti di interesse e renderle più facili da purificare. I tag comunemente utilizzati includono His-tag, proteina legante alla maltosio (MBP), glutatione-s-transferasi (GST), ecc.
Di solito, una sequenza di collegamento viene aggiunta tra il tag di fusione e la sequenza della proteina target per rimuovere il tag. La rimozione dei tag di fusione richiede proteasi sito-specifiche, come enterochina (EK), trombina, proteasi del virus dell'increspatura del tabacco (TEVp), proteasi virale umana 3C (HRV3C), proteasi della piccola proteina modificatrice ubiquitina (SUMO), proteasi del virus del mosaico venato del tabacco (TVMV) e peptidasi carbossi A/B (CPA/CPB).
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TIPO
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Enzimi
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Sito di Riconoscimento
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Endoproteasi per la Rimozione dei Tag
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Enterochina (EK), enteropeptidasi
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DDDDK↓
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trombina
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LVPR↓GS
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Proteasi TEV
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ENLYFQ↓G
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Proteasi HRV3C
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LEVLFQ↓GP
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Proteasi SUMO
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Struttura terziaria SUMO
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Proteasi TVMV
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ETVRFQG↓S
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Esoproteasi per rimozione dei tag
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Carbossipeptidasi A (CPA)
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Aminoacidi terminali C, eccetto Pro, Lys e Arg
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Carbossipeptidasi B (CPB)
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Lys e Arg terminali C
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Altre Proteasi, Nucleasi e Amidasi
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APPLICAZIONE
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Enzimi
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Funzione
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Altre proteasi
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Proteasi K
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Una serina proteasi che digerisce le proteine idrolizzando i legami peptidici.
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IdeS, IgG proteasi
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Enzimi degradanti IgG (Ides) che tagliano in un sito specifico dell'immunoglobulina G (IgG), generando frammenti Fab e Fc
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Proteasi IgA1
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Un enzima proteolitico che taglia un sito specifico nella sequenza della regione cardine dell'immunoglobulina A1 umana (IgA1).
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Nuclease
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Nuclease
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Taglia gli acidi nucleici (DNA o RNA) idrolizzando i legami fosfodiesterici.
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Restrict enzima
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Un endonucleasi che taglia il DNA a o vicino a siti specifici.
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Amidasi
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PNGase F
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Si scinde tra il glucosamine (GlcNAc) N-acetil più interno e i residui di asparagina degli oligosaccaridi a alto mannoso, ibridi e complessi.
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Riferimento:
[1] Hennigan JN, Lynch MD. Il passato, il presente e il futuro delle terapie a base di enzimi. Drug Discov Today. 2022 Gen;27(1):117-133. doi: 10.1016/j.drudis.2021.09.004.
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