Sviluppo del processo a monte

CDMO microbico

L'importanza dello sviluppo del processo a monte

Il processo a monte (USP), noto anche come processo di fermentazione, è una delle fasi iniziali del bioprocesso a monte. Il processo di fermentazione microbica è fondamentale per la coltura cellulare ad alta densità e l'espressione genica esogena, che influisce direttamente sulla resa e sul costo dei prodotti biologici.

Nelle prime fasi dello sviluppo dei prodotti biologici (preclinico o fase 1/2), l’obiettivo è sviluppare processi scalabili senza animali con resa intermedia e soddisfare tutti gli standard di qualità del prodotto.

Nelle fasi finali (fase 3 o commerciale), ci concentreremo su resa, robustezza, scalabilità e riproducibilità, generando un processo economicamente efficiente. Le attività che affrontano questi problemi sono la caratterizzazione del processo e gli studi di validazione del processo. Nel frattempo, vengono generalmente applicati strumenti di qualità fin dalla progettazione (QbD) e di progettazione degli esperimenti (DoE).

Parole chiave: sviluppo, ottimizzazione e validazione del processo, processo di fermentazione, fermentazione cellulare microbica, fermentazione batterica, fermentazione del lievito, fermentazione ad alta densità, fermentazione con ceppi ingegnerizzati

Applicazione: industria biofarmaceutica, medicina umana, medicina animale, vaccino, prodotti biologici ricombinanti a grandi molecole, prodotti biologici ricombinanti, reagenti biologici

Soluzioni USP di Yaohai Bio-Pharma

Beneficiando di oltre 10 anni di esperienza nella fermentazione microbica, Yaohai Bio-Pharma ha l'esperienza per aiutare a risolvere le sfide del processo di fermentazione. Possiamo stabilire rapidamente strategie di fermentazione ad alta densità per Escherichia coli (E. coli) secrezione periplasmatica, espressione di corpi solubili o inclusi intracellulari ed espressione extracellulare o intracellulare di lievito.

I nostri servizi generali di sviluppo della fermentazione disponibili includono:

Progettazione del processo di fermentazione eseguito su piccola scala di 7 litri in modalità fed-batch
Convalida del processo in tre lotti in fermentatori da 7 litri
Un processo intermedio scalabile fino a 30 l/70 l

Possiamo eseguire in modo flessibile l'ottimizzazione multiparametrica per soddisfare la resa o la proporzione desiderata, utilizzando One-Time-A-Factor (OTAF) o Design-of-experiments (DoE).

I parametri chiave della fermentazione sono elencati di seguito:

Composizioni di mezzi di fermentazione senza animali

Privo di antibiotici o meno, volume dell'inoculo

Temperatura di crescita, pH, livello di ossigeno disciolto (DO).

Modalità di alimentazione (ad esempio, fed-batch)

Concentrazione dell'induttore (ad es. IPTG, metanolo), punto di induzione (peso umido della cella/OD600),

Temperatura di induzione, tempo di induzione

ecc.

i dettagli del servizio

Servizi	Flusso di processo
Coltivazione in Shake Flask (500 ml)	Preparazione dei terreni senza animali → Coltivazione di semi microbici → Coltivazione in shaker → Induzione → Raccolta
Coltivazione nel fermentatore (7 L)	Preparazione dei terreni senza animali → Coltivazione di semi microbici → Fermentazione cellulare ad alta densità in bioreattore da 7 litri → Induzione → Raccolta
Controllo di qualità di proteine/peptidi	Pretrattamento Espressione solubile intracellulare: raccolta e risospensione delle cellule microbiche → Frantumazione ad ultrasuoni → Rimozione dei detriti cellulari → Estratto grezzo Espressione del corpo di inclusione: raccolta e risospensione delle cellule microbiche → Frantumazione ad ultrasuoni → preparazione del corpo di inclusione → Estratto grezzo Espressione solubile extracellulare: raccolta del surnatante della coltura → Concentrazione e tampone scambio → Estratto grezzo Analisi della qualità Estratto grezzo come campione → Analisi della proteina target mediante SDS PAGE o Western blotting (WB)
Controllo di qualità dei plasmidi	Pretrattamento e analisi della qualità Estrazione del plasmide → Analisi del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio

Caso di studio

Il nostro cliente ci ha incaricato di aumentare la resa dell'ormone polipeptidico target da 8 g/L a 10 g/L.

Sulla base del Full Factorial Design e del Response Surface Design negli strumenti DoE, abbiamo riconosciuto e ottimizzato rapidamente i parametri chiave della fermentazione. Durante il processo di fermentazione ottimizzato ad alta densità cellulare, il livello di espressione è aumentato a 10 g/L.

Le nostre esperienze

Abbiamo lavorato su vari tipi di ospiti microbici, ad esempio, E.coli DH5α, TOP10, Trans10, BL21; Pichia pastoris (P. pastoris) SMD1168H, X-33, GS115, PichiaRosa ceppo1/2/3/4; Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) e l' Hansenula polimorfa (H. polymorpha).
Abbiamo esperienza con E. coli secrezione periplasmatica, espressione di corpi solubili e inclusi, nonché espressione intracellulare o extracellulare di lievito. La resa del corpo incluso arriva fino a 10 g/L, mentre la resa delle proteine solubili varia da 0.5 a 15 g/L.
Siamo stati coinvolti nello sviluppo e nella produzione di varie molecole di grandi dimensioni, inclusi vaccini a subunità ricombinanti, particelle simili a virus (VLP), ormoni (insulina, GLP-1, ormone della crescita), citochine (Interleuchina-2/IL-2, IL -15, IL-21), fattori di crescita (EGF, FGF, NGF), nanobodies/anticorpi a dominio singolo (sdAbs), enzimi, ecc.
Materiale

Sistema di fermentazione 7L*16

Cedex Bio Analyser, analizzatore di bioprocessi

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