Enzimi chiave per la produzione di RNA lungo
il mRNA, come tipo di RNA codificante lungo, ha dimostrato sicurezza ed efficienza in un più ampio numero di persone durante la pandemia di COVID-19. Altri RNA codificanti lunghi, come l'RNA autoricostitutivo (saRNA) e il circRNA (RNA circolare), hanno mostrato efficienza negli studi preclinici e clinici.
La produzione su larga scala di RNA codificante lungo si basa sulla trascrizione in vitro (IVT) tramite diverse reazioni enzimatiche. I passaggi della produzione di RNA includono la preparazione del DNA template, la sintesi dell'RNA IVT, la circolazione, la rimozione del DNA, la modifica dell'RNA (cappatura e coda), e la purificazione dell'RNA.
Ci sono diversi enzimi chiave utilizzati nella produzione di RNA codificante lungo (ad esempio, mRNA, saRNA e circRNA), tra cui endonucleasi a ristrizione, polimerasi T7 RNA (T7 RNAP), inibitore di RNase, pirrofosfatasi inorganica, DNase I, enzima di cappatura vacciniale e RNase R.
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Processo
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Enzima
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Funzione
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Preparazione del DNA template
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Endonucleasi di restrizione
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Linearizzazione del DNA plasmidico (pDNA) per evitare la generazione di trascritti più lunghi.
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Sintesi di RNA in vitro (IVT)
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T7 RNA polimerasi (T7 RNAP)
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Legarsi al promotore T7 e generare trascritti RNA specifici; Giocano un ruolo chiave durante la reazione IVT.
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Inibitore di RNase, ricombinante
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Inibire l'attività di RNase durante la reazione IVT.
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Pirofosfatasi, inorganica (iPPase)
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Prevenire la formazione di pirofosfato durante la reazione IVT.
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Rimozione del DNA
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DNase I
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Rimuovi il template DNA.
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Modificazione dell'RNA
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Enzima di cappatura della vaccinia
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Aggiungi strutture Cap1 alle estremità 5′ dell'mRNA sintetizzato in vitro (IVT).
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2’-O-Metiltransferasi
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arricchimento di circRNA
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Rnase R
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Digerisci l'RNA lineare e arricchisci l'RNA circolare.
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