Sintesi in vitro di mRNA
I principali componenti dell'mRNA sono il 5'-cap, il 5'-UTR, il frame di lettura aperto (ORF), il 3'-UTR e la coda poli-A, che sono essenziali per mantenere la funzione dell'mRNA. I ricercatori hanno utilizzato una varietà di metodi per identificare e ottimizzare le sequenze e le strutture dell'mRNA.
La sintesi dell'mRNA viene eseguita sulla base della trascrizione in vitro (IVT) utilizzando template DNA lineari, polimerasi RNA (T3, T7 o SP6), nucleotidi non modificati o modificati, enzimi e reagenti appropriati.
modifica del 5' Cap
Le sequenze di mRNA maturo da eucariote mostrano un cappuccio di 7-metilguanosina (m7G) all'estremità 5', che migliora la stabilità dell'mRNA e l'efficienza traduzionale. Esistono due metodi generali per catturare l'mRNA in vitro. Primo, l'mRNA può essere cappucciato insieme al trascritto in vitro aggiungendo un analogo del cappuccio della struttura m7GpppG (ad esempio, CleanCap) al sistema IVT. Questo metodo di cappuccio co-trascrizionale fornisce una struttura naturale di capsule 5' e aumenta l'efficienza di cappuccio fino a quasi il 90-99%. In secondo luogo, la mappatura dell'mRNA può anche essere realizzata tramite reazioni enzimatiche successive alla reazione di trascrizione in vitro.
Modificazione PolyA
La coda poly(A) estende inoltre la mezza vita dell'mRNA in vivo e migliora l'efficienza di traduzione dell'mRNA. La lunghezza della coda poly(A) amplificata dovrebbe essere di 100-300 nucleotidi. Inoltre, l'adenosina modificata aumenta la stabilità della coda poly A contro la degradazione da parte delle RNasi cellulari. La coda poly A può essere inserita tramite trascrizione in vitro utilizzando un template DNA che codifica per la sequenza poly A, risultando così in una lunghezza specifica della sequenza poly A. È possibile utilizzare anche la polimerasi poly A ricombinante per la poliadenilazione enzimatica dopo la trascrizione dell'mRNA.
Modifiche dei Nucleotidi
I nucleosidi modificati possono inibire il riconoscimento e/o l'attivazione dei recettori di riconoscimento del pattern (PRR) e migliorare l'efficacia dei vaccini mRNA in due modi completamente diversi. L'aggiunta di alcuni nucleosidi chimicamente modificati, inclusi pseudouridina (ψ), 1-metilpseudouridina (m1ψ), tiouridina (s4U) e 5-metilcitosina (m5C), può prevenire l'attivazione di TLR7/8 e altri recettori immunitari innati, riducendo significativamente l'immunogenicità dell'mRNA.
sistema di Consegna di mRNA
Per mantenere la funzione dell'mRNA, è necessario che esso entri nel citoplasma dell'ospite ed esprima antigeni specifici. Una delle sfide più difficili con cui si confrontano i vaccini e le terapie mRNA consiste nella consegna dell'mRNA nelle cellule bersaglio con livelli di traduzione sufficientemente alti, il che richiede sistemi di consegna dell'mRNA altamente specifici ed efficienti. Sono stati sviluppati e utilizzati diversi vettori di consegna di mRNA, tra cui le cellule dendritiche (DCs), la protamina, polimeri catيونici e liposomi cat-ionici.
Complessi di lipidi cationici con mRNA e altre preparazioni possono formare collettivamente nanoparticelle di dimensioni comprese tra 80-200 nm, note come nanoparticelle lipidiche (LNPs). Tra i sistemi di consegna di mRNA più avanzati, LNP include lipidi cationici ionizzabili, fosfolipidi naturali, colesterolo e polietilen glicole (PEG). Alcuni vaccini RNA e terapie (siRNA e mRNA) approvati dall'U.S. Food and Drug Administration si basano su sistemi di consegna LNP.
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Consegne Personalizzate
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Grado
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Consegne
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Specifiche
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Applicazioni
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non-GMP
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Sostanza Farmaceutica, mRNA
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0,1~10 mg (mRNA)
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Ricerca preclinica come trasfazione cellulare, Sviluppo di metodi analitici, Studi di prestabilità, Sviluppo di formulazioni
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Drug Product, LNP-mRNA
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GMP, Sterilità
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Sostanza Farmaceutica, mRNA
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10 mg~70 g
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Investigational new drug (IND), Autorizzazione per il saggio clinico (CTA), Fornitura per saggio clinico, Richiesta di licenza biologica (BLA), Fornitura commerciale
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Drug Product, LNP-mRNA
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5000 flaconi o siringhe prefissate/ cartridge
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