I dati della mappatura di peptidi basati su Cromatografia Liquida - Spettrometria di Massa (LC-MS) forniranno una grande quantità di informazioni sulla struttura primaria e superiore delle proteine native e ricombinanti, inclusi la copertura della sequenza degli aminoacidi, le modifiche post-traduzionali (PTMs, ad esempio, glicosilazione, ossidazione, deamidazione), legami disolfuro, ecc.
Yaohai Bio-Pharma offre servizi di analisi di mappatura di peptidi per la vostra proteina target tramite LC-MS, per accelerare le vostre ricerche sulla struttura proteica.
Siamo stati coinvolti nella Caratterizzazione Strutturale delle Proteine di vari grandi molecole, tra cui Vaccini Ricombinanti a Sottounita', Nanocorpi/VHHs/Corpi Antigenici Singolo-dominio (sdAbs), Frammenti di Antibodi, Ormoni/Peptidi, Cytokine, Fattori di Crescita (GF), Enzimi, Collagene, ecc.
Requisiti Regolatori per la Mappatura di Peptidi
La guida ICHQ6B raccomanda: "La frammentazione selettiva del prodotto in peptidi discreti viene eseguita utilizzando enzimi o sostanze chimiche adatti e i frammenti peptidici risultanti vengono analizzati tramite cromatografia a fase inversa (HPLC) o altre procedure analitiche appropriate. I frammenti peptidici dovrebbero essere identificati il più possibile utilizzando tecniche come l'analisi della composizione degli aminoacidi, la sequenziatura terminale N o la spettrometria di massa (MS). La mappatura peptidica della sostanza attiva o del prodotto farmaceutico (DP) utilizzando un metodo opportunamente validato è un metodo spesso utilizzato per confermare la struttura del prodotto desiderato per la rilascio del lotto."
Metodi Analitici
| Analisi |
Metodi |
| Mappatura dei Peptidi |
Digestione con Proteasi e Cromatografia Liquida-Coupled Spettrometria di Massa (LC-MS) |
Procedura Analitica
1. Riduzione e Alchilazione
Lo scopo è quello di ridurre i ponti di disolfuro e bloccare il tiolo libero generato. La riduzione dei ponti di disolfuro aiuta ad aprire la struttura della proteina, rendendo la digestione proteolitica più efficiente. Questo passaggio romperà anche i ponti tra le catene nel caso di proteine multi-catena che abbiano ponti di disolfuro che collegano le catene (ad esempio, anticorpi monoclonali, mAb).
2. Digestione della Proteina Utilizzando Enzimi
Lo scopo è quello di degradare la proteina in peptidi. Abbiamo scelto gli enzimi in base alla sequenza teorica della proteina e alle conoscenze sulla digestione teorica della proteina da parte degli enzimi. Scegliere gli enzimi in questo modo dovrebbe risultare nella migliore analisi della mappatura peptidica.
3. Analisi dei Peptidi Digesti Utilizzo della Cromatografia a Fase Inversa-On-line con Rendimento Alte Prestazioni con Rilevazione Ultravioletta (UV) e Spettrometria di Massa ad Elettrospray (LC/ES-MS).
Separazione dei peptidi in base alla polarità utilizzando LC (fase inversa-LC)
Mentre il peptido si eluisce dalla colonna LC, lo spettrometro di massa genererà informazioni di massa insieme a informazioni sugli ioni frammenti, il che ci permette di determinare le informazioni sulla sequenza. Usiamo le informazioni sulla sequenza per confermare l'identità del peptido e fornire informazioni di primo livello.
Possiamo inoltre generare le informazioni di frammentazione dai peptidi mentre entrano nella sorgente dello spettrometro di massa dalla colonna LC. A seconda dei requisiti dello studio, questo è sia LC-MS/MS selettivo o non selettivo, che può essere considerato una forma di MS tandem.
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