I dati di mappatura dei peptidi basati sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) forniranno una grande quantità di informazioni sulla struttura primaria e di ordine superiore delle proteine native e ricombinanti, inclusa la copertura della sequenza di amminoacidi, le modifiche post-traduzionali (PTM, ad es. , ossidazione, deammidazione), legami disolfuro, ecc.
Yaohai Bio-Pharma offre servizi di analisi di mappatura dei peptidi per la tua proteina target mediante LC-MS, per accelerare la tua ricerca sulla struttura delle proteine.
Siamo stati coinvolti nella caratterizzazione strutturale proteica di varie molecole di grandi dimensioni, inclusi vaccini con subunità ricombinanti, nanocorpi/VHH/anticorpi a dominio singolo (sdAb), frammenti di anticorpi, ormoni/peptidi, citochine, fattori di crescita (GF), enzimi, collageni, eccetera.
Requisiti normativi per la mappatura dei peptidi
La linea guida ICHQ6B raccomanda: “La frammentazione selettiva del prodotto in peptidi distinti viene eseguita utilizzando enzimi o sostanze chimiche adatti e i frammenti peptidici risultanti vengono analizzati mediante HPLC o altra procedura analitica appropriata. I frammenti peptidici dovrebbero essere identificati, per quanto possibile, utilizzando tecniche quali l'analisi della composizione degli aminoacidi, il sequenziamento N-terminale o la spettrometria di massa (MS). La mappatura dei peptidi del principio attivo o del prodotto farmaceutico (DP) utilizzando un metodo opportunamente convalidato è un metodo spesso utilizzato per confermare la struttura del prodotto desiderata per il rilascio dei lotti”.
Metodi analitici
| Analisi |
Metodi |
| Mappatura dei peptidi |
Digestione delle proteasi e cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) |
Procedura analitica
1. Riduzione e alchilazione
Lo scopo è ridurre i ponti disolfuro e bloccare il tiolo libero generato. La riduzione dei ponti disolfuro aiuta ad aprire la struttura proteica rendendo la digestione proteolitica più efficiente. Questo passaggio romperà anche i ponti tra le catene nel caso di proteine multicatena che hanno ponti disolfuro che collegano le catene (ad esempio anticorpi monoclonali, mAb).
2. Digestione delle proteine mediante enzimi
Lo scopo è scomporre la proteina in peptidi. Abbiamo scelto gli enzimi in base alla sequenza teorica della proteina e alla conoscenza della digestione teorica della proteina da parte degli enzimi. Scegliendo gli enzimi in questo modo, si dovrebbe ottenere la migliore analisi di mappatura dei peptidi.
3. Analisi dei peptidi digeriti Utilizzo della cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa in linea con rilevamento ultravioletto (UV) e spettrometria di massa elettrospray (LC/ES-MS).
Separazione dei peptidi basata sulla polarità mediante LC (LC a fase inversa)
Quando il peptide eluisce dalla colonna LC, lo spettrometro di massa genererà informazioni sulla massa insieme a informazioni sui frammenti ionici, che ci consentono di determinare le informazioni sulla sequenza. Utilizziamo le informazioni sulla sequenza per confermare l'identità del peptide e fornire informazioni primarie.
Possiamo anche generare informazioni sulla frammentazione dai peptidi quando entrano nella sorgente dello spettrometro di massa dalla colonna LC. A seconda dei requisiti dello studio, si tratta di LC-MS/MS selettiva o non selettiva, che può essere considerata come una forma di MS tandem.
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