L'occupazione del sito di N-glicosilazione è una caratteristica fisiologica delle glicoproteine e produce principalmente N-glicano. Il servizio di analisi dell'occupazione del sito di N-glicosilazione di Yaohai Bio-Pharma viene condotto attraverso la digestione, il rilascio, l'arricchimento e l'analisi utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray-spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS).
Siamo stati coinvolti nella caratterizzazione strutturale proteica di varie molecole di grandi dimensioni, inclusi vaccini con subunità ricombinanti, nanocorpi/VHH/anticorpi a dominio singolo (sdAb), frammenti di anticorpi, ormoni/peptidi, citochine, fattori di crescita (GF), enzimi, collageni, eccetera.
Requisiti normativi per l'occupazione del sito di N-glicosilazione
Secondo la linea guida ICH Q6B, “per le glicoproteine, viene determinato il contenuto di carboidrati (zuccheri neutri, aminozuccheri e acidi sialici). Inoltre, la struttura delle catene di carboidrati, il modello oligosaccaridico (profilo antennario) e il/i sito/i di glicosilazione della catena polipeptidica vengono analizzati nella migliore misura possibile.
Metodo analitico
| Analisi |
Metodi |
| Occupazione del sito di N-glicosilazione |
LC-MS dopo digestione deglicosilasi e proteasi |
Procedure
1. Digestione proteica delle proteine per generare piccoli frammenti peptidici.
2. Rilascio di N-glicani utilizzando endoglicosidasi H o PNGasi F. L'endoglicosidasi H scinde il legame tra i due residui GlcNAc nel nucleo dei glicani N-legati, mentre PNGasi F è una glicoamidasi che recide il legame tra GlcNAc e Asn, liberando l'intero catena dello zucchero e conversione di Asn in Asp con aumento di massa di 1-Da.
3. Arricchimento di N-glicopeptide tramite HILIC (cromatografia liquida di interazione idrofila)
4. Analisi dell'occupazione del sito di glicosilazione legata all'N mediante LC-ESI-MS/MS.
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