L'occupazione del sito di N-glicosilazione è una caratteristica fisiologica delle glicoproteine e produce principalmente N-glicane. Il servizio di analisi dell'occupazione del sito di N-glicosilazione di Yaohai Bio-Pharma viene eseguito attraverso digestione, rilascio, arricchimento e analisi utilizzando la Cromatografia Liquida-Ionizzazione per Spruzzo Elettrospray Spettrometria di Massa-Spettrometria di Massa (LC-ESI-MS/MS).
Siamo stati coinvolti nella Caratterizzazione Strutturale delle Proteine di vari grandi molecole, tra cui Vaccini Ricombinanti a Sottounita', Nanocorpi/VHHs/Corpi Antigenici Singolo-dominio (sdAbs), Frammenti di Antibodi, Ormoni/Peptidi, Cytokine, Fattori di Crescita (GF), Enzimi, Collagene, ecc.
Requisiti Regolatori per l'Occupazione del Sito di N-glicosilazione
Secondo la guida ICH Q6B, “per i glicoproteine, si determina il contenuto di carboidrati (zuccheri neutri, zuccheri amminici e acidi sialici). Inoltre, si analizza la struttura delle catene di carboidrati, il pattern degli oligosaccaridi (profilo antennario) e i siti di glicosilazione della catena polipeptidica nel modo più completo possibile.”
Metodo Analitico
| Analisi |
Metodi |
| Occupazione del sito di N-glicosilazione |
LC-MS dopo digestione con deglicosidasi e proteasi |
Procedure
1. Digestione delle proteine per generare piccoli frammenti di peptidi.
2. Rilascio degli N-glicani utilizzando endoglicosidasi H o PNGase F. L'endoglicosidasi H scinde il legame tra i due residui di GlcNAc nel nucleo dei glicani legati a N, mentre la PNGase F è una glicoamidasi che taglia il legame tra GlcNAc e Asn, liberando l'intera catena zuccherina e convertendo Asn in Asp con un aumento di massa di 1-Da.
3. Arricchimento degli N-glicopeptidi tramite HILIC (Cromatografia Liquida ad Interazione Idrofila)
4. Analisi dell'occupazione dei siti di glicosilazione legata a N utilizzando LC-ESI-MS/MS.
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