MRNA合成に関わる技術

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体外でのmRNA合成

MRNAの主要な構成要素は、5’-キャップ、5’-UTR、オープンリーディングフレーム（ORF）、3’-UTR、および3’ポリAテールであり、これらはmRNA機能を維持するために必要です。研究者たちは、さまざまな方法を用いてmRNA配列と構造を特定し、最適化してきました。

MRNAの合成は、線状DNAテンプレート、RNAポリメラーゼ（T3、T7、またはSP6）、変性または非変性核酸、酵素、および適切な試薬を使用した体外転写（IVT）に基づいて行われます。

5’ キャップ修飾

真核細胞の成熟mRNAの配列は、5’末端に7-メチルグアノシン（m7G）キャップを持ち、これによりmRNAの安定性と翻訳効率が向上します。体外でmRNAを捕獲する方法には主に2つあります。まず、m7GpppG構造（例：CleanCap）のキャップアナログをIVTシステムに添加することで、体外転写物をキャップすることができます。この共転写キャッピング法は自然な5'キャップ構造を提供し、キャッピング効率をほぼ90-99%に高めます。また、体外転写反応後にマッピング酵素反応を行うことで、mRNAマッピングも達成できます。

ポリA修飾

ポリ(A)テールは、体内でのmRNAの半減期を延長し、mRNAの翻訳効率を向上させます。増幅されたポリ(A)テールの長さは100〜300ヌクレオチドであるべきです。さらに、修飾アデノシンは細胞内のRNaseによる分解に対するポリ(A)テールの安定性を高めます。ポリ(A)テールは、ポリ(A)をコードするDNAテンプレートを使用して体外転写によって挿入され、これにより特定のポリ(A)配列長が得られます。また、再構成ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、mRNA転写後に酵素によるポリアデニル化を行うこともできます。

核酸の修飾

変性核酸は、パターン認識受容体 (PRR) の認識および／または活性化を阻害し、2つの全く異なる方法でmRNAワクチンの効果を向上させることができます。特定の化学的に変性された核酸、例えばプセウドウリジン (ψ)、1-メチルプセウドウリジン (m1ψ)、チオウリジン (s4U)、5-メチルシトシン (m5C) を添加することで、TLR7/8や他の先天的免疫受容体の活性化を防ぎ、これによりmRNAの免疫原性が大幅に低下します。

mRNA送達システム

MRNAの機能を維持するためには、ホスト細胞の細胞質に入り、特定の抗原を発現する必要があります。mRNAワクチンや治療薬が直面する最も難しい課題の一つは、十分な翻訳レベルでターゲット細胞内にmRNAを送達することであり、これは非常に特異的で効率的なmRNA送達システムを必要とします。いくつかのmRNA送達ベクターが開発され使用されており、その中には樹状細胞 (DCs)、プロタミン、陽イオン性ポリマー、陽イオン性リポソームが含まれます。

陽イオン性脂質の複合体とmRNAやその他の準備物は、総称して80-200ナノメートルサイズのナノ粒子、いわゆる脂質ナノ粒子（LNPs）を形成します。最も進んだmRNA配信システムの一つとして、LNPには電離可能な陽イオン性脂質、天然リン脂質、コレステロール、およびポリエチレングリコール（PEG）が含まれます。アメリカ食品医薬品局によって承認されたいくつかのRNAワクチンや治療法（siRNAおよびmRNA）は、LNP配信システムに基づいています。

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