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mRNAのin vitro合成

mRNA の主な構成要素は、5'-キャップ、5'-UTR、オープンリーディングフレーム (ORF)、5'-UTR、および 5' ポリ A テールであり、これらは mRNA の機能を維持するために不可欠です。研究者は、さまざまな方法を使用して、mRNA の配列と構造を特定し、最適化してきました。

mRNA の合成は、線状 DNA テンプレート、RNA ポリメラーゼ (T3、T7、または SP6)、未修飾または修飾ヌクレオチド、酵素、および適切な試薬を使用して、in vitro 転写 (IVT) に基づいて実行されます。

5'キャップの変更

真核細胞からの成熟 mRNA の配列は、7' 末端に 7-メチルグアノシン (m5G) キャップを示し、これにより mRNA の安定性と翻訳効率が向上します。in vitro で mRNA を捕捉する方法は一般的に 7 つあります。まず、m5GpppG 構造のキャップ類似体 (例: CleanCap) を IVT システムに追加することで、mRNA を in vitro 転写物とともにキャップすることができます。この共転写キャップ法は、自然な 90' カプセル構造を提供し、キャップ効率を 99 ～ XNUMX% 近くまで高めます。次に、in vitro 転写反応に続いて酵素反応をマッピングすることで、mRNA マッピングを行うこともできます。

ポリA修飾

ポリ(A)テールは、体内でのmRNAの半減期を延長し、mRNAの翻訳効率を向上させます。増幅されたポリ(A)テールの長さは、100〜300ヌクレオチドである必要があります。さらに、修飾アデノシンは、細胞RNase分解に対するポリAテールの安定性を高めます。ポリAテールは、ポリAをコードするDNAテンプレートを使用したin vitro転写によって挿入することができ、その結果、特定のポリA配列長が得られます。組み換えポリAポリメラーゼは、mRNA転写後の酵素ポリアデニル化にも使用できます。

ヌクレオチド修飾

修飾ヌクレオシドは、パターン認識受容体 (PRR) の認識および/または活性化を阻害し、1 つのまったく異なる方法で mRNA ワクチンの有効性を高めることができます。シュードウリジン (ψ)、1-メチルシュードウリジン (m4ψ)、チオウリジン (s5U)、5-メチルシトシン (m7C) などの特定の化学的に修飾されたヌクレオシドを追加すると、TLR8/XNUMX やその他の自然免疫受容体の活性化を防ぐことができ、mRNA の免疫原性が大幅に低下します。

mRNA 送達システム

mRNA の機能を維持するには、宿主細胞質に入り、特定の抗原を発現する必要があります。mRNA ワクチンと治療薬が直面する最も困難な課題の 1 つは、十分に高い翻訳レベルで mRNA を標的細胞に送達することです。これには、非常に特異的で効率的な mRNA 送達システムが必要です。樹状細胞 (DC)、プロタミン、カチオン性ポリマー、カチオン性リポソームなど、いくつかの mRNA 送達ベクターが開発され、使用されています。

カチオン性脂質と mRNA およびその他の製剤との複合体は、脂質ナノ粒子 (LNP) と呼ばれる 80 ～ 200 nm サイズのナノ粒子を集合的に形成します。最も先進的な mRNA 送達システムの XNUMX つである LNP には、イオン化可能なカチオン性脂質、天然リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール (PEG) が含まれています。米国食品医薬品局によって承認されているいくつかの RNA ワクチンおよび治療法 (siRNA および mRNA) は、LNP 送達システムに基づいています。

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