円形RNA（circRNA）

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循環RNA（circRNA）は、1979年に非コードRNAとして初めて発見されました。2015年までに、果蠅で転写されたcircRNAが発見され、これが治療および予防目的でのin vitro circRNAの研究につながりました。

circRNAは自己拡大型であるため、5'キャップや3'ポリAテールなどの従来の構造を持たず、この構造により彼らはより安定し、RNase Rのようなエクソヌクレアーゼに対して抵抗性があります。

循環RNA（circRNA）の構造要素

CircRNA合成のためのテンプレートDNAには、通常、内部リボソーム進入サイト（IRES）、開かれたリーディングフレーム（ORF）など、in vitro循環に重要な要素が含まれます。例えば、我々はホモロジー腕、3'インtron、3'エクソン、IRES、ORF、5'エクソン、5'インtronを含むプラスミドを設計し、自己スプライシング法によってcircRNAを準備しました。

内部リボソーム進入サイト (IRES) は、cirRNA の翻訳において重要な役割を果たします。エンセファロミオカーディチスウイルス (EMCV) IRES、コクサッキーウイルス B3 (CVB3) IRES、ヒトノーズウイルス B3 (HRV-B3) IRES その他の IRES は、cirRNA の体外合成の翻訳に一般的に利用されてきました。

CircRNA 直鎖前駆体の体内サイクリゼーションは、circRNA 合成における重要なステップです。通常、化学的、酵素的、およびリボソーム媒介の自己複製経路を通じて行われます。この分野におけるマイルストーンとされる化学的アプローチによる circRNA の生成は、1988年に始まりましたが、コストが高く、収率が低く、副産物が多いこと、そして70塩基以下の RNA のみを対象としているため、今日では使用されなくなりました。

RNAのサイクリングを行うための酵素法は、T4 DNAリガーゼ (T4 Dnl 1)、T4 RNAリガーゼ1 (T4 Rnl 1)、およびT4 RNAリガーゼ2 (T4 Rnl 2) のような細菌ファージT4由来の酵素やリボザイムに基づいています。T4バクテリオファージ酵素で円形RNAを形成するには、ヌクレオシド一リン酸がRNAの5'末端に位置し、3'末端のOH基と結合している必要があります。反応中にヌクレオシド三リン酸が加えられるため、IVT RNAには5'末端にグアノシン三リン酸 (GTP) が含まれます。

リボザイムは、追加の酵素を必要とせずに線状RNA分子をcircRNAに変換する自己スプライシングを促進するRNA配列です。自己組み立てプロセスには、所望のcirRNA製品が形成されるように特定の部位で二つの連続的なトランスエステル化反応が含まれます。5 kbを超える長さのcirRNAを生成できるグループIインロンの自己スプライシング法、別名PIE（インロンおよびエクソンカプセル化）は広く研究され、有用性が証明されています。

円形RNA (circRNA) の応用

CircRNA ワクチン

線状mRNAと同様に、circRNAは標的細胞で特定のタンパク質に変換され、強力な体液免疫および細胞性免疫を誘発することができます。最近、いくつかの研究チームが成功裡にCOVID-19を予防するためのcircRNAワクチンを開発しました。彼らの結果は、線状mRNAワクチンの利点を持つだけでなく、より優れた安定性と、線状mRNAよりも長いタンパク質発現期間を示しました。したがって、circRNAワクチンは低用量でも十分な免疫応答を誘導できます。

さらに、一部の研究者は、次世代mRNAとしてのcircRNAワクチンが、将来的に一般的なウイルス／細菌感染症や主要な新興感染症との闘いにおいて有効なツールとなり、また癌その他の疾患の治療にも役立つ可能性があると考えています。

CAR／TCR-T療法におけるcircRNA

円形RNA分野の先駆者として、ORNAはLNPカプセル化された円形RNA（ORN-101）を用いたオンサイト治療のためのイン・シトウキメラ抗原受容体（CAR）療法を開発しています。これは、患者の免疫細胞を調整するために使用されます。ORN-101は、最適化されたIRES要素によって駆動されるCARの高発現を示します。動物モデルでは、ORN-101が腫瘍の抑制と破壊を誘導することが示され、ORN-101に基づく抗癌療法が従来のCAR-T細胞療法に影響を与える可能性があることを示唆しています。

さらに、張氏らは抗原特異的T細胞受容体（TCR）-T療法におけるcircRNAの生存能および治療効果を評価しました。彼らは、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）のpp65エピトープを標的とするpp65-TCR-TをエンコードするcircRNAを設計しました。さらに、pp65-TCRは7日以上主T細胞で発現することが示されました。さらに、circRNA-pp65-TCR-T細胞は、pp65およびHLAを発現する腫瘍細胞を特定して一貫して殺し、マウスの生存時間を大幅に延長しました。

また、pp65 circRNAで転写された細胞は、線形mRNAと比較してより優れた免疫応答を示したことが明らかにされました。

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