Sintesi in vitro dell'mRNA
I componenti principali dell'mRNA sono 5'-cap, 5'-UTR, open reading frame (ORF), 5'-UTR e 5' poly A tail, che sono essenziali per il mantenimento della funzione dell'mRNA. I ricercatori hanno utilizzato una varietà di metodi per identificare e ottimizzare le sequenze e le strutture dell'mRNA.
La sintesi dell'mRNA viene eseguita sulla base del trascritto in vitro (IVT) utilizzando modelli di DNA lineare, RNA polimerasi (T3, T7 o SP6), nucleotidi non modificati o modificati, enzimi e reagenti appropriati.
Modifica del cappuccio da 5'
Le sequenze di mRNA maturo degli eucariociti mostrano un cappuccio di 7-metilguanosina (m7G) all'estremità 5', che migliora la stabilità dell'mRNA e l'efficienza traduzionale. Esistono due metodi generali per catturare l'mRNA in vitro. Innanzitutto, l'mRNA può essere bloccato insieme alla trascrizione in vitro aggiungendo un analogo cap della struttura m7GpppG (ad esempio, CleanCap) al sistema IVT. Questo metodo di tappatura co-trascrizionale fornisce una struttura naturale della capsula da 5' e aumenta l'efficienza della tappatura fino a quasi il 90-99%. In secondo luogo, la mappatura dell'mRNA può essere effettuata anche mappando le reazioni enzimatiche successive alla reazione di trascrizione in vitro.
Modifica PolyA
La coda poli(A) estende anche l'emivita dell'mRNA in vivo e migliora l'efficienza della traduzione dell'mRNA. La lunghezza della coda del poli(A) amplificato dovrebbe essere di 100-300 nucleotidi. Inoltre, l'adenosina modificata aumenta la stabilità della coda di poli A contro la degradazione della RNasi cellulare. La coda di poli A può essere inserita mediante trascrizione in vitro utilizzando uno stampo di DNA che codifica il poli A, ottenendo così una lunghezza specifica della sequenza di poli A. La poli A polimerasi ricombinante può essere utilizzata anche mediante poliadenilazione enzimatica dopo la trascrizione dell'mRNA.
Modificazione dei nucleotidi
I nucleosidi modificati possono inibire il riconoscimento e/o l’attivazione dei recettori per il riconoscimento di pattern (PRR) e migliorare l’efficacia dei vaccini mRNA in due modi totalmente diversi. L'aggiunta di alcuni nucleosidi chimicamente modificati tra cui pseudouridina (ψ), 1-metilpseudouridina (m1ψ), tiouridina (s4U) e 5-metilcitosina (m5C) può impedire l'attivazione di TLR7/8 e di altri recettori immunitari innati, che riducono significativamente l'immunogenicità di mRNA.
Sistema di consegna dell'mRNA
Per mantenere la funzione dell'mRNA, è necessario che entri nel citoplasma dell'ospite ed esprima antigeni specifici. Una delle sfide più difficili che devono affrontare i vaccini e le terapie a mRNA risiede nel fornire l'mRNA nelle cellule bersaglio con livelli di traduzione sufficientemente elevati poiché richiede sistemi di rilascio dell'mRNA altamente specifici ed efficienti. Sono stati sviluppati e utilizzati diversi vettori di rilascio di mRNA, tra cui cellule dendritiche (DC), protamina, polimeri cationici e liposomi cationici.
Complessi di lipidi cationici con mRNA e altri preparati possono formare collettivamente nanoparticelle di dimensioni pari a 80-200 nm denominate nanoparticelle lipidiche (LNP). Essendo uno dei sistemi di rilascio di mRNA più avanzati, l'LNP comprende lipidi cationici ionizzabili, fosfolipidi naturali, colesterolo e polietilenglicole (PEG). Diversi vaccini e terapie a RNA (siRNA e mRNA) approvati dalla Food and Drug Administration statunitense si basano su sistemi di rilascio LNP.
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Risultati personalizzati
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Classe
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Risultati finali
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Specificazione
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Applicazioni
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non GMP
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Sostanza farmaceutica, mRNA
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0.1~10 mg (mRNA)
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Ricerca preclinica come trasfezione cellulare, sviluppo di metodi analitici, studi di pre-stabilità, sviluppo di formulazioni
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Prodotto farmaceutico, LNP-mRNA
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GMP, sterilità
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Sostanza farmaceutica, mRNA
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10mg~70 g
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Nuovo farmaco sperimentale (IND), Autorizzazione per sperimentazione clinica (CTA), Fornitura per sperimentazione clinica, Richiesta di licenza biologica (BLA), Fornitura commerciale
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Prodotto farmaceutico, LNP-mRNA
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5000 flaconcini o siringhe/cartucce preriempite
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