Gli RNA circolari (circRNA) sono stati scoperti per la prima volta come RNA non codificanti nel 1979; non è stato fino al 2015 che si sono trovati circRNA trascritti in Drosophila, il che ha portato allo studio di circRNA in vitro a fini terapeutici e preventivi.
i circRNA si espandono da soli e quindi non hanno una struttura convenzionale come un cappuccio 5' o una coda polyA 3'. Questa struttura li rende più stabili e resistenti agli esonucleasi come l'RNase R.
Elementi strutturali dell'RNA circolare (circRNA)
Il DNA template per la sintesi di circRNA include tipicamente un sito di entrata del ribosoma interno (IRES), un frame di lettura aperto (ORF) e altri elementi critici per la circolazione in vitro. Ad esempio, abbiamo progettato un plasmide come template per la trascrizione in vitro (IVT), che comprende bracci di omologia, introne 3', esone 3', IRES, ORF, esone 5' e introne 5', per preparare circRNA tramite metodi di autosplicing.
Il sito di entrata interna del ribosoma (IRES) svolge ruoli importanti nella traduzione delle cirRNAs. Gli IRES del virus dell'encefalomiocardite (EMCV), del coxsackievirus B3 (CVB3), del rhinovirus umano B3 (HRV-B3) e altri IRES sono stati comunemente utilizzati per la traduzione della sintesi in vitro delle cirRNAs.
La ciclizzazione in vivo dei precursori lineari delle circRNA rappresenta un passo importante nella sintesi delle circRNA, solitamente attraverso percorsi chimici, enzimatici e mediati dal ribosoma per l'autoreplicazione. Conosciuto come una pietra miliare nel campo, il metodo chimico per la produzione di circRNA, sviluppato nel 1988, non viene più utilizzato oggi a causa del suo alto costo, basso rendimento, elevato numero di prodotti secondari e del fatto che è adatto solo alla ciclizzazione di RNA fino a 70 nucleotidi di lunghezza.
I metodi enzimatici per la ciclizzazione del RNA si basano su enzimi del batteriofago T4 o ribozimi come la ligasi DNA T4 (T4 Dnl 1), la ligasi RNA T4 1 (T4 Rnl 1) e la ligasi RNA T4 2 (T4 Rnl 2). Per formare RNA circolare con gli enzimi del batteriofago T4, i monofosfati di nucleoside devono essere posizionati all'estremità 5' e coniugati al gruppo OH all'estremità 3' del RNA. Poiché durante la reazione vengono aggiunti trifosfati di nucleoside, l'RNA IVT contiene guanosina trifosfato (GTP) all'estremità 5’.
I ribozimi sono sequenze di RNA che promuovono lo splicing autonomo convertendo molecole di RNA lineari in circRNA senza la necessità di enzimi aggiuntivi. Il processo di auto-assemblaggio prevede due reazioni consecutive di transesterificazione a siti specifici per assicurare la formazione dei prodotti cirRNA desiderati. Il metodo di auto-splicing degli introni di gruppo I, noto anche come PIE (incapsulamento di introni ed esoni), che consente la produzione di cirRNA più lunghi di 5 kb, è stato ampiamente studiato e ha dimostrato di essere utile.
Applicazione del RNA circolare (circRNA)
Vaccini circRNA
Come gli mRNA lineari, i circRNA possono essere convertiti in determinate proteine nelle cellule bersaglio e indurre una robusta immunità umorale e cellulare. Recentemente, alcune squadre di ricerca hanno sviluppato con successo vaccini circRNA per prevenire il COVID-19. I loro risultati non solo hanno posseduto i vantaggi dei vaccini a mRNA lineare, ma hanno anche dimostrato una maggiore stabilità e una durata più lunga dell'espressione proteica rispetto agli mRNA lineari. Pertanto, i vaccini circRNA possono indurre risposte immunitarie adeguate anche a dosi basse.
Inoltre, alcuni ricercatori ritengono che i vaccini circRNA, come le future generazioni di mRNA, potrebbero diventare strumenti efficaci nel futuro per combattere malattie virali/batteriche comuni e principali malattie infettive emergenti, nonché per il trattamento del cancro e altre malattie.
CircRNA nella terapia CAR/TCR-T
Come pioniere nel campo dell'RNA circolare, ORNA sta sviluppando una terapia in situ con recettori chimici antigenici (CAR) per la terapia in situ che utilizza ORN-101, un RNA circolare encapsulato in LNP, per modulare le cellule immunitarie nei pazienti. L'ORN-101 presenta un'espressione elevata del CAR guidata da un elemento IRES ottimizzato. Nei modelli animali, l'ORN-101 ha dimostrato di indurre la soppressione e la distruzione dei tumori, suggerendo che le terapie antitumorali basate su ORN-101 potrebbero interferire con la terapia tradizionale CAR-T.
Inoltre, Zhang et al. hanno valutato la viabilità ed l'efficacia terapeutica delle circRNA nelle terapie TCR-T specifiche per antigene. Hanno progettato una circRNA che codifica pp65-TCR-T che si dirige contro l'epitope pp65 del citomegalovirus (CMV). Inoltre, il pp65-TCR è stato dimostrato essere espresso sulle cellule T primarie per più di 7 giorni. Inoltre, le cellule circRNA-pp65-TCR-T uccidono in modo specifico e costante le cellule tumorali che esprimono pp65 e HLA e prolungano significativamente il tempo di sopravvivenza dei topi.
È stato inoltre dimostrato che le cellule trasfette con pp65 circRNA hanno mostrato risposte immunitarie migliori rispetto all'mRNA lineare.
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