Krožne RNA (circRNA) so bile prvič odkrite kot nekodirajoče RNA leta 1979; šele leta 2015 so pri Drosophili našli prepisane circRNA, kar je privedlo do študije in vitro circRNA za terapevtske in preventivne namene.
circRNA se samorazširjajo in zato nimajo običajne strukture, kot je 5' cap ali 3' polyA tail. Ta struktura jih naredi bolj stabilne in odporne na eksonukleaze, kot je RNaza R.
Elementi strukture krožne RNA (circRNA)
Predloga DNK za sintezo circRNA običajno vključuje vstopno mesto notranjega ribosoma (IRES), odprt bralni okvir (ORF) in druge, ki so kritični za cirkulacijo in vitro. Zasnovali smo na primer plazmid kot šablono za prepis in vitro (IVT), ki je sestavljen iz homolognih krakov, 3' introna, 3' eksona, IRES, ORF, 5' eksona in 5' introna, da pripravimo circRNA s samospojitvijo metode.
Notranje vstopno mesto ribosoma (IRES) ima pomembno vlogo pri prevajanju cirRNA. Virus encefalomiokarditisa (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, človeški rinovirus B3 (HRV-B3) IRES in drugi IRES so bili pogosto uporabljeni za prevajanje vitro sinteze cirRNA
In vivo ciklizacija linearnih prekurzorjev circRNA zagotavlja pomemben korak v sintezi circRNA, običajno prek kemičnih, encimskih in z ribosomi posredovanih poti samopodvajanja. Kemični pristop za proizvodnjo circRNA, ki je bil znan kot mejnik na tem področju, se je pojavil leta 1988, danes pa se ne uporablja več zaradi visokih stroškov, nizkega izkoristka, velikega števila stranskih produktov in dejstva, da je primeren le za cikliziranje RNA do dolžine 70 nukleotidov.
Encimske metode za cikliziranje RNA temeljijo na encimih ali ribozimih bakteriofaga T4, kot je T4 DNA ligaza (T4 Dnl 1), T4 RNA ligaza 1 (T4 Rnl 1) in T4 RNA ligaza 2 (T4 Rnl 2). Za tvorbo krožne RNA z encimi bakteriofaga T4 morajo biti nukleozidni monofosfati locirani na 5' koncu in konjugirani na OH skupino na 3' koncu RNA. Ker se med reakcijo dodajo nukleozidni trifosfati, IVT RNA vsebuje gvanozin trifosfat (GTP) na 5' koncu.
Ribozimi so zaporedja RNA, ki spodbujajo samospojitev s pretvorbo linearnih molekul RNA v circRNA brez potrebe po dodatnih encimih. Proces samosestavljanja vključuje dve zaporedni reakciji transesterifikacije na določenih mestih, da zagotovimo tvorbo želenih produktov cirRNA. Metoda samospojitve intronov skupine I, znana tudi kot PIE (enkapsulacija intronov in eksonov), ki omogoča proizvodnjo cirRNA, daljših od 5 kb, je bila obsežno raziskana in se je izkazala za uporabno.
Uporaba krožne RNA (circRNA)
Cepiva CircRNA
Tako kot linearne mRNA se lahko circRNA pretvorijo v določene proteine v ciljnih celicah in inducirajo močno humoralno in celično imunost. Nedavno je nekaj raziskovalnih skupin uspešno razvilo cepiva circRNA za preprečevanje COVID-19. Njihovi rezultati niso imeli le prednosti linearnih cepiv mRNA, temveč so se ponašali tudi z boljšo stabilnostjo in daljšim trajanjem izražanja beljakovin kot linearna mRNA. Zato lahko circRNA cepiva povzročijo ustrezne imunske odzive tudi pri nizkih odmerkih.
Poleg tega nekateri raziskovalci menijo, da bi lahko cepiva circRNA kot mRNA naslednje generacije v prihodnosti postala učinkovito orodje za boj proti pogostim virusnim/bakterijskim boleznim in večjim nastajajočim nalezljivim boleznim, pa tudi za zdravljenje raka in drugih bolezni.
CircRNA v terapiji CAR / TCR-T
Kot pionir na področju krožne RNK je ORNA razvijala in situ terapijo s himernim antigenskim receptorjem (CAR) za in situ terapijo, ki uporablja ORN-101, v LNP inkapsulirano krožno RNK, za modulacijo imunskih celic pri bolnikih. ORN-101 predstavlja visoko izražanje CAR, ki ga poganja optimiziran element IRES. Na živalskih modelih je bilo dokazano, da ORN-101 inducira supresijo in uničenje tumorja, kar nakazuje, da lahko terapije proti raku na osnovi ORN-101 motijo konvencionalno terapijo s celicami CAR-T.
Poleg tega so Zhang et al. ocenili sposobnost preživetja in terapevtsko učinkovitost circRNA v terapijah T-celičnega receptorja TCR (TCR)-T. Zasnovali so circRNA, ki kodira pp65-TCR-T in cilja na epitop pp65 citomegalovirusa (CMV). Poleg tega je dokazano, da se pp65-TCR izraža na primarnih celicah T več kot 7 dni. Poleg tega so celice circRNA-pp65-TCR-T specifično in dosledno ubile tumorske celice, ki izražajo pp65 in HLA, in znatno podaljšale čas preživetja miši.
Pokazalo se je tudi, da so celice, transficirane s pp65 circRNA, pokazale boljše imunske odzive v primerjavi z linearno mRNA.
Yaohaijeva rešitev Bio-Pharma CRDMO na enem mestu za dolgo kodirajočo RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
