Krožne RNK (circRNA) so bile prvič odkrivene kot nekodirajoče RNK leta 1979; a ni bilo, da bi se transkribirane circRNA našle v Drosophilah le leta 2015, kar je pripeljalo do študija in vitro circRNA za terapevtske in preventivne namene.
circRNA se sama razširijo in zato nimajo običajne strukture, kot je 5' kapa ali 3' poliA rep. Ta struktura jih dela stabilnejše in bolj oduporne pred exonukleazi, kot je RNase R.
Strukturni elementi krožne RNA (circRNA)
DNA šablon za sintezo circRNA tipično vsebuje notranji vhodni lok ribosoma (IRES), odprto berljivo okvirje (ORF) in druge, ki so ključni za cirkulacijo v laboratoriju. Na primer, smo dizajnirali plazmid kot šablon za transkripcijo v laboratoriju (IVT), ki sestavlja homologne roke, 3’ intron, 3’ ekson, IRES, ORF, 5’ ekson in 5’ intron, da pripravimo circRNA s samospajnimi metodami.
Notranji vhodni lok ribosoma (IRES) opravlja pomembne vloge pri prevajanju cirRNA-jev. IRES encefalomiokarditne vire (EMCV), IRES koksakievirusa B3 (CVB3), IRES človeškega rinovirusa B3 (HRV-B3) in drugi IRES so bili pogosto uporabljeni za prevajanje vitro sinteze cirRNA-jev.
Ciklizacija v vivo linearnih predhodnikov circRNA-ja predstavlja pomemben korak v sintezi circRNA-ja, običajno prek kemikalnih, enzymatskih in ribosomski medijatorjenih samoponovitvenih poti. Poznana kot milja kamen v tem področju, kemikalni pristop za proizvodnjo circRNA-ja, ki se je izvirno pojavil leta 1988, ni več v uporabi danes zaradi visoke cene, nizečega izida, velikega števila stranskih produktov in dejstva, da je primern le za ciklizacijo RNA-jev dolgih do 70 nukleotidov.
Enzymatske metode za ciklizacijo RNA so temeljile na enzimih bakteriophage T4 ali ribozomih, kot so ligaza T4 DNA (T4 Dnl 1), ligaza T4 RNA 1 (T4 Rnl 1) in ligaza T4 RNA 2 (T4 Rnl 2). Za oblikovanje krožne RNA z enzimi bakteriophage T4 morajo biti nukleozidni monofosfatniki postavljeni na 5' koncu in povezani z OH skupino na 3' koncu RNA. Ker se nukleozidni trifosfatniki dodajajo med reakcijo, vsebuje IVT RNA guanozinski trifosfat (GTP) na 5’ koncu.
Ribozomi so RNA zaporedja, ki spodbujajo samospliceiranje tako, da pretvarjajo linearno RNA v circRNA brez potrebe po dodatnih enzimih. Proces samosestavljanja vključuje dve zaporedni transesterifikacijski poskuse na določenih mestih, da se zagotovi, da bodo nastali željeni izdelki cirRNA. Metoda samospliceiranja skupine I intronov, tudi znana kot PIE (inkapsulacija intronov in eksonov), ki omogoča proizvodnjo cirRNA daljših od 5 kb, je bila podrobno raziskana in se je izkazala kot uporabna.
Uporaba krožnih RNA (circRNA)
CircRNA cepivi
Kot linearni mRNA-ji se lahko tudi circRNA-ji v ciljnih celicah pretvorijo v določene proteine in izvajajo močno humoralno in celično imunost. Nedavno so nekateri raziskovalni skupine uspešno razvili circRNA cepiva za preprečevanje COVID-19. Njihovi rezultati ne le, da vsebujejo prednosti linearnih mRNA cepiv, ampak tudi kažejo na boljšo stabilnost in daljši čas izražanja proteina v primerjavi z linearnimi mRNA-ji. Zato lahko circRNA cepiva izvajajo primerno imunsko odziv celo pri nizkih dozah.
Vendar menijo nekateri raziskovalci, da bodo circRNA cepiva, kot naslednja generacija mRNA-jev, v prihodnosti morda postala učinkovite orodja za boj proti običajnim virusnim/bakterijskim boleznim in glavnim novim zaravnim boleznim, ter za ravnanje s rakom in drugimi boleznmi.
CircRNA v CAR/TCR-T terapiji
Kot pionir v področju krogelastega RNA, ORNA razvija terapijo z lokacijsko chimernim antigenom (CAR) za lokacijsko terapo, ki uporablja ORN-101, krogelastni RNA oblečen v LNP, da modulira imunsko celice pri pacientih. ORN-101 prikazuje visoko izražanje CAR, ki ga vodi optimiziran element IRES. V živalskih modelih je bilo pokazano, da ORN-101 prispeva k potiskovanju in uničenju raka, kar namiguje, da so ORN-101 bazirane protirakovinske terapije morda sposobne konkurirati tradicionalnim CAR-T celularnim terapijam.
Poleg tega so Zhang in sodelavci ocenili preživetnost in terapevtsko učinkovitost circRNA v antigen-specifičnih TCR-T terapijah. Zasnovejo circRNA, ki kodira pp65-TCR-T, usmerjen v epitop pp65 citomegalovirusa (CMV). Poleg tega je bilo dokazano, da se pp65-TCR izraža na primarnih T celicah več kot 7 dni. Poleg tega specifično in zanesljivo uničujejo circRNA-pp65-TCR-T celice tumorne celice, ki izražajo pp65 in HLA, ter znatno podaljšajo preživetje miši.
Tudi je bilo pokazano, da se celice, transfece z pp65 circRNA, obnašajo s boljše odzive imune skupnosti v primerjavi z linearnim mRNA.
Yaohaijev Bio-Pharma eno-točkovni CRDMO rešitev za dolgo kodiranjo RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
