อาร์เอ็นเอวงกลม (circRNAs) ถูกค้นพบครั้งแรกในฐานะอาร์เอ็นเอที่ไม่ได้เข้ารหัสในปี 1979; จนกระทั่งปี 2015 จึงพบว่า circRNAs ถูกถอดรหัสใน Drosophila สิ่งนี้นำไปสู่การศึกษา circRNAs ในหลอดทดลองเพื่อวัตถุประสงค์ในการรักษาและการป้องกัน
circRNAs มีการขยายตัวด้วยตนเองและจึงไม่มีโครงสร้างแบบเดิม เช่น แคป 5' หรือหาง polyA 3' โครงสร้างนี้ทำให้พวกมันมีเสถียรภาพมากขึ้นและต้านทานต่อ exonucleases เช่น RNase R ได้
องค์ประกอบโครงสร้างของอาร์เอ็นเอวงกลม (circRNA)
ดีเอ็นเอเทมเพลตสำหรับการสังเคราะห์ circRNA มักจะรวมถึงไซต์การเข้าสู่ไรโบโซมภายใน (IRES), กรอบการอ่านเปิด (ORF) และอื่น ๆ ที่สำคัญสำหรับการหมุนเวียนในหลอดทดลอง ตัวอย่างเช่น เราออกแบบพลาสมิดเป็นเทมเพลตสำหรับการถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) ซึ่งประกอบด้วยแขนโฮโมโลจี, อินตรอน 3', เอ็กซอน 3', IRES, ORF, เอ็กซอน 5' และอินตรอน 5' เพื่อเตรียม circRNA โดยใช้วิธีการตัดต่อย้อนกลับด้วยตนเอง
ไซต์การเข้าสู่ไรโบโซมภายใน (IRES) มีบทบาทสำคัญในกระบวนการแปลรหัส cirRNAs IRES ของไวรัส Encephalomyocarditis (EMCV), IRES ของไวรัส Coxsackievirus B3 (CVB3), IRES ของไวรัส Rhinovirus ชนิด B3 ในมนุษย์ (HRV-B3) และ IRES อื่น ๆ ได้ถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายสำหรับการแปลรหัสการสังเคราะห์ vitro ของ cirRNAs
การหมุนเวียนใน vivo ของตัวก่อนหน้าเชิงเส้นของ circRNA เป็นขั้นตอนสำคัญในการสังเคราะห์ circRNA โดยทั่วไปผ่านทางเคมี เอนไซม์ และเส้นทางการจำลองตนเองที่ถูกควบคุมโดยไรโบโซม ซึ่งเป็นจุดเปลี่ยนในวงการ การใช้วิธีทางเคมีในการผลิต circRNA ซึ่งเริ่มต้นขึ้นในปี 1988 ไม่ได้ถูกใช้งานในปัจจุบันเนื่องจากต้นทุนสูง ผลผลิตต่ำ มีสารประกอบรองจำนวนมาก และสามารถหมุนเวียน RNA ที่มีความยาวไม่เกิน 70 นิวคลีโอไทด์เท่านั้น
วิธีการด้วยเอนไซม์สำหรับการทำ RNA ให้เป็นวงกลมขึ้นอยู่กับเอนไซม์ของไวรัสแบคทีเรีย T4 หรือ ribozymes เช่น T4 DNA ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1) และ T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2) เพื่อสร้าง RNA วงกลมโดยใช้เอนไซม์ของไวรัส T4 โมโนฟอสเฟตของนิวคลีโอไซด์จะต้องอยู่ที่ปลาย 5' และเชื่อมโยงกับหมู่ OH ที่ปลาย 3' ของ RNA เนื่องจากโมเลกุลของไตรฟอสเฟตของนิวคลีโอไซด์ถูกเพิ่มลงไปในระหว่างปฏิกิริยา IVT RNA จะมี guanosine triphosphate (GTP) ที่ปลาย 5’
Ribozymes เป็นลำดับ RNA ที่ช่วยในการตัดต่อตัวเอง โดยแปลง RNA สายตรงให้กลายเป็น circRNA โดยไม่จำเป็นต้องใช้เอนไซม์เพิ่มเติม กระบวนการประกอบตัวเองเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยา transesterification สองครั้งติดต่อกันที่ตำแหน่งเฉพาะเพื่อให้มั่นใจว่าผลิตภัณฑ์ cirRNA ที่ต้องการจะถูกสร้างขึ้น วิธีการตัดต่อตัวเองของกลุ่ม I intron ซึ่งรู้จักกันในชื่อ PIE (intron and exon encapsulation) ได้รับการศึกษาอย่างละเอียดและพิสูจน์แล้วว่ามีประโยชน์ โดยสามารถผลิต cirRNAs ที่ยาวกว่า 5 kb ได้
การประยุกต์ใช้ RNA วงกลม (circRNA)
วัคซีน circRNA
เช่นเดียวกับ mRNA แบบเส้นตรง circRNA สามารถเปลี่ยนเป็นโปรตีนบางชนิดในเซลล์เป้าหมายและกระตุ้นภูมิคุ้มกันของร่างกายทั้งแบบเลือดและเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพ ล่าสุด มีทีมนักวิจัยหลายกลุ่มที่พัฒนาวัคซีน circRNA เพื่อป้องกัน COVID-19 ได้อย่างสำเร็จ ผลลัพธ์เหล่านี้ไม่เพียงแต่มีข้อดีเหมือนวัคซีน mRNA แบบเส้นตรงเท่านั้น แต่ยังมีความเสถียรดีกว่าและระยะเวลาการแสดงออกของโปรตีนยาวนานกว่า mRNA แบบเส้นตรง อีกทั้งวัคซีน circRNA ยังสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เพียงพอแม้จะใช้ปริมาณต่ำ
นอกจากนี้ นักวิจัยบางคนเชื่อว่าวัคซีน circRNA ในฐานะ mRNA เจเนอเรชันถัดไปอาจกลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในอนาคตสำหรับการต่อสู้กับโรคไวรัส/แบคทีเรียทั่วไป โรคติดเชื้อที่เกิดใหม่สำคัญ และยังสามารถใช้ในการรักษามะเร็งและโรคอื่น ๆ ได้อีกด้วย
circRNA ในการบำบัด CAR / TCR-T
ในฐานะผู้บุกเบิกในด้านของ RNA วงกลม ORNA ได้พัฒนาการบำบัดด้วยตัวรับแอนติเจนแบบเชื่อม (CAR) ในสถานที่สำหรับการบำบัดในสถานที่ โดยใช้ ORN-101 ซึ่งเป็น RNA วงกลมที่ห่อหุ้มด้วย LNP เพื่อปรับเปลี่ยนเซลล์ภูมิคุ้มกันในผู้ป่วย ORN-101 มีการแสดงออกสูงของ CAR ที่ขับเคลื่อนโดยองค์ประกอบ IRES ที่ได้รับการปรับปรุง ในแบบจำลองสัตว์ ORN-101 แสดงให้เห็นถึงการกดและทำลายเนื้องอก ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการบำบัดมะเร็งด้วย ORN-101 อาจแทรกแซงการบำบัดด้วย CAR-T cell แบบเดิม
นอกจากนี้ Zhang และคณะได้ประเมินความเป็นไปได้และความมีประสิทธิภาพของการบำบัดด้วย circRNA ใน T-cell receptor (TCR)-T ที่เฉพาะเจาะจงต่อแอนติเจน พวกเขาออกแบบ circRNA ที่เข้ารหัส pp65-TCR-T ที่มุ่งเป้าไปที่ epitope pp65 ของไวรัสไซโตเมกาโลไวรัส (CMV) นอกจากนี้ pp65-TCR ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถแสดงออกบนเซลล์ T หลักได้นานกว่า 7 วัน อีกทั้งเซลล์ circRNA-pp65-TCR-T สามารถฆ่าเซลล์มะเร็งที่แสดง pp65 และ HLA อย่างเฉพาะเจาะจงและสม่ำเสมอ และยืดอายุเฉลี่ยของหนูอย่างมีนัยสำคัญ
ยังแสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่ถูกทรานสเฟคต์ด้วย pp65 circRNA มีการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ดีกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ linear mRNA
Yaohai’s Bio-Pharma One-Stop CRDMO Solution สำหรับ Long-Coding RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
