Cirkulære RNA'er (circRNA'er) blev først opdaget som ikke-kodende RNA'er i 1979; det var først i 2015, at transskriberede circRNA'er blev fundet i Drosophila, hvilket førte til undersøgelsen af in vitro circRNA'er til terapeutiske og forebyggende formål.
circRNA'er er selvekspanderende og har derfor ikke en konventionel struktur såsom en 5' cap eller 3' polyA hale. Denne struktur gør dem mere stabile og modstandsdygtige over for exonukleaser som RNase R.
Strukturelementer af cirkulært RNA (circRNA)
Skabelon-DNA'et til circRNA-syntese inkluderer typisk internt ribosomindgangssted (IRES), åben læseramme (ORF) og andre, der er kritiske for in vitro-cirkulation. For eksempel designet vi et plasmid som in vitro transcript (IVT) skabelon, som består af homologi arme, 3' intron, 3' exon, IRES, ORF, 5' exon og 5' intron, for at fremstille circRNA ved selvsplejsning metoder.
Internal Ribosome Entry Site (IRES) spiller vigtige roller i oversættelsen af cirRNA'er. Encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, human rhinovirus B3 (HRV-B3) IRES og andre IRES er almindeligvis blevet brugt til translation af vitro syntesen af cirRNA'er
In vivo cyklisering af circRNA lineære precursorer giver et vigtigt trin i circRNA syntese, sædvanligvis gennem kemiske, enzymatiske og ribosom-medierede selvreplikationsveje. Kendt som en milepæl på området, bruges den kemiske tilgang til circRNA-produktion, der stammer fra 1988, ikke længere i dag på grund af dens høje omkostninger, lave udbytte, høje antal biprodukter og det faktum, at den kun er egnet til cyklisering RNA'er op til 70 nukleotider lange.
Enzymatiske metoder til cyklisering af RNA er baseret på bakteriofag T4-enzymer eller ribozymer, såsom T4 DNA-ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA-ligase 1 (T4 Rnl 1) og T4 RNA-ligase 2 (T4 Rnl 2). For at danne cirkulært RNA af T4-bakteriofagenzymer skal nukleosidmonofosfater være placeret i 5'-enden og konjugeret til OH-gruppen i 3'-enden af RNA'et. Fordi nukleosidtrifosfater tilsættes under reaktionen, indeholder IVT RNA guanosintrifosfat (GTP) i 5'-enden.
Ribozymer er RNA-sekvenser, der fremmer selvsplejsning ved at omdanne lineære RNA-molekyler til circRNA uden behov for yderligere enzymer. Selvsamlingsprocessen involverer to på hinanden følgende transesterificeringsreaktioner på specifikke steder for at sikre, at de ønskede cirRNA-produkter dannes. Gruppe I-intron-selvsplejsningsmetoden, også kendt som PIE (intron- og exonindkapsling), som tillader produktion af cirRNA'er længere end 5 kb, er blevet grundigt undersøgt og har vist sig nyttig.
Anvendelse af cirkulært RNA (circRNA)
CircRNA-vacciner
Ligesom lineære mRNA'er kan circRNA'er omdannes til visse proteiner i målceller og inducere den robuste humorale og cellulære immunitet. For nylig er der nogle forskerhold, som med succes udviklede circRNA-vacciner for at forhindre COVID-19. Deres resultater har ikke kun haft fordelene ved lineære mRNA-vacciner, men kan også prale af en bedre stabilitet og længere varighed af proteinekspression end lineær mRNA. Derfor kan circRNA-vacciner inducere tilstrækkelige immunresponser selv ved lave doser.
Derudover mener nogle forskere, at circRNA-vacciner, som næste generations mRNA'er, kan blive effektive værktøjer i fremtiden til at bekæmpe almindelige virus-/bakteriesygdomme og store nye infektionssygdomme samt til behandling af kræft og andre sygdomme.
CircRNA i CAR / TCR-T terapi
Som en pioner inden for cirkulært RNA har ORNA udviklet in situ kimær antigenreceptor (CAR) terapi til in situ terapi, der anvender ORN-101, et LNP-indkapslet cirkulært RNA, til at modulere immunceller hos patienter. ORN-101 præsenterer et højt udtryk af CAR drevet af et optimeret IRES-element. I dyremodeller blev ORN-101 vist at inducere tumorundertrykkelse og destruktion, hvilket tyder på, at ORN-101-baserede anticancerterapier kan interferere med konventionel CAR-T-celleterapi.
Derudover har Zhang et al. evaluerede levedygtigheden og den terapeutiske effektivitet af circRNA'er i antigenspecifikke T-cellereceptor (TCR)-T-terapier. De designede et circRNA, der koder for pp65-TCR-T rettet mod pp65-epitopen af cytomegalovirus (CMV). Derudover er pp65-TCR vist at blive udtrykt på primære T-celler i over 7 dage. Derudover dræbte circRNA-pp65-TCR-T-celler specifikt og konsekvent pp65- og HLA-udtrykkende tumorceller og forlængede signifikant overlevelsestiden for mus.
Det blev også vist, at celler transficeret med pp65 circRNA udviste bedre immunresponser sammenlignet med lineært mRNA.
Yaohai's Bio-Pharma One-Stop CRDMO-løsning til langkodende RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
INGEN
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
