Synthèse in vitro de l'ARNm
Les principaux composants de l'ARNm sont le 5’-cap, le 5’-UTR, le cadre ouvert de lecture (ORF), le 3’-UTR et la queue poly A 3’, qui sont essentiels pour maintenir la fonction de l'ARNm. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodes pour identifier et optimiser les séquences et structures d'ARNm.
La synthèse de l'ARNm est réalisée sur la base de transcription in vitro (IVT) à l'aide de modèles d'ADN linéaires, de polymérases ARN (T3, T7 ou SP6), de nucléotides non modifiés ou modifiés, d'enzymes et de réactifs appropriés.
Modification du 5’ cap
Les séquences d'ARNm mature provenant de la cellule eucaryote présentent un cap de 7-méthylguanosine (m7G) à l'extrémité 5', qui améliore la stabilité de l'ARNm et l'efficacité de la traduction. Il existe deux méthodes générales pour capturer l'ARNm in vitro. Premièrement, l'ARNm peut être chapeauté simultanément avec le transcript in vitro en ajoutant un analogue de cap de structure m7GpppG (par exemple, CleanCap) au système IVT. Cette méthode de chapeautage co-transcriptionnel fournit une structure naturelle de capsule 5' et augmente l'efficacité du chapeautage à près de 90-99 %. Deuxièmement, le cartographiage de l'ARNm peut également être réalisé par des réactions enzymatiques de cartographie après la réaction de transcription in vitro.
Modification PolyA
La queue poly(A) prolonge également la demi-vie de l'ARNm in vivo et améliore l'efficacité de la traduction de l'ARNm. La longueur de la queue poly(A) amplifiée doit être de 100 à 300 nucléotides. De plus, l'adénosine modifiée augmente la stabilité de la queue poly A contre la dégradation par les RNases cellulaires. La queue poly A peut être insérée par transcription in vitro en utilisant un modèle d'ADN codant pour la séquence poly A, ce qui aboutit à une longueur spécifique de la séquence poly A. Une poly(A) polymérase recombinante peut également être utilisée pour la polyadenylation enzymatique après la transcription de l'ARNm.
Modification des nucléotides
Les nucléosides modifiés peuvent inhiber la reconnaissance et/ou l'activation des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR) et améliorer l'efficacité des vaccins à ARNm de deux manières totalement différentes. L'ajout de certains nucléosides chimiquement modifiés, y compris la pseudouridine (ψ), la 1-méthylpseudouridine (m1ψ), la thiouridine (s4U) et la 5-méthylcytosine (m5C), peut prévenir l'activation des TLR7/8 et d'autres récepteurs immunitaires innés, ce qui réduit considérablement l'immunogénicité de l'ARNm.
Système de livraison d'ARNm
Pour maintenir la fonction de l'ARNm, il doit pénétrer dans le cytoplasme de l'hôte et exprimer des antigènes spécifiques. L'un des défis les plus difficiles auxquels sont confrontés les vaccins et thérapies à base d'ARNm réside dans la livraison de l'ARNm dans les cellules cibles avec des niveaux de traduction suffisamment élevés, ce qui nécessite des systèmes de livraison d'ARNm très spécifiques et efficaces. Plusieurs vecteurs de livraison d'ARNm ont été développés et utilisés, y compris les cellules dendritiques (DCs), la protamine, les polymères catióniques et les liposomes catióniques.
Les complexes de lipides cationiques avec l'ARNm et d'autres préparations peuvent collectivement former des nanoparticules de 80-200 nm appelées nanoparticules lipidiques (LNPs). L'une des plateformes de livraison d'ARNm les plus avancées, le LNP, comprend des lipides cationiques ionisables, des phospholipides naturels, du cholestérol et du polyéthylène glycol (PEG). Plusieurs vaccins à ARN et thérapies (siRNA et ARNm) approuvés par l'Administration américaine des produits alimentaires et pharmaceutiques sont basés sur des systèmes de livraison LNP.
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Livraisons
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Spécification
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