ARN circulaire (circRNA)

Modalité

Les ARN circulaires (circRNA) ont été découverts pour la première fois en tant qu'ARN non codants en 1979 ; ce n’est qu’en 2015 que des circARN transcrits ont été découverts chez la drosophile, ce qui a conduit à l’étude des circARN in vitro à des fins thérapeutiques et préventives.

Les circARN sont auto-expansibles et n'ont donc pas de structure conventionnelle telle qu'une coiffe 5' ou une queue polyA 3'. Cette structure les rend plus stables et résistants aux exonucléases comme la RNase R.

Éléments de structure de l'ARN circulaire (circRNA)

La matrice d'ADN pour la synthèse des circARN comprend généralement le site d'entrée interne du ribosome (IRES), le cadre de lecture ouvert (ORF) et d'autres qui sont essentiels à la circulation in vitro. Par exemple, nous avons conçu un plasmide comme modèle de transcription in vitro (IVT), composé de bras d'homologie, d'intron 3', d'exon 3', d'IRES, d'ORF, d'exon 5' et d'intron 5', pour préparer le circARN par auto-épissage. méthodes.

Le site d’entrée interne du ribosome (IRES) joue un rôle important dans la traduction des cirARN. Le virus de l'encéphalomyocardite (EMCV) IRES, le virus coxsackie B3 (CVB3) IRES, le rhinovirus humain B3 (HRV-B3) IRES et d'autres IRES ont été couramment utilisés pour la traduction de la synthèse vitro de cirARN.

La cyclisation in vivo des précurseurs linéaires des circARN constitue une étape importante dans la synthèse des circARN, généralement par des voies d'auto-réplication chimiques, enzymatiques et médiées par les ribosomes. Connue comme une étape importante dans le domaine, l'approche chimique pour la production de circRNA, née en 1988, n'est plus utilisée aujourd'hui en raison de son coût élevé, de son faible rendement, du nombre élevé de sous-produits et du fait qu'elle ne convient que pour la cyclisation. ARN jusqu'à 70 nucléotides de longueur.

Les méthodes enzymatiques de cyclisation de l'ARN sont basées sur des enzymes ou des ribozymes du bactériophage T4 tels que la T4 ADN ligase (T4 Dnl 1), la T4 ARN ligase 1 (T4 Rnl 1) et la T4 ARN ligase 2 (T4 Rnl 2). Pour former un ARN circulaire par les enzymes du bactériophage T4, les nucléosides monophosphates doivent être situés à l'extrémité 5' et conjugués au groupe OH à l'extrémité 3' de l'ARN. Étant donné que des nucléosides triphosphates sont ajoutés au cours de la réaction, l'ARN IVT contient du guanosine triphosphate (GTP) à l'extrémité 5'.

Les ribozymes sont des séquences d'ARN qui favorisent l'auto-épissage en convertissant les molécules d'ARN linéaires en circARN sans avoir besoin d'enzymes supplémentaires. Le processus d'auto-assemblage implique deux réactions de transestérification consécutives sur des sites spécifiques pour garantir la formation des produits cirARN souhaités. La méthode d’auto-épissage des introns du groupe I, également connue sous le nom de PIE (encapsulation d’intron et d’exon), qui permet la production de cirARN de plus de 5 kb, a été largement étudiée et s’est avérée utile.

Application de l'ARN circulaire (circRNA)

Vaccins CircRNA

Comme les ARNm linéaires, les circARN peuvent être convertis en certaines protéines dans les cellules cibles et induire une solide immunité humorale et cellulaire. Récemment, certaines équipes de recherche ont développé avec succès des vaccins à ARNcirc pour prévenir le COVID-19. Leurs résultats présentent non seulement les avantages des vaccins à ARNm linéaire, mais se vantent également d’une meilleure stabilité et d’une durée d’expression protéique plus longue que l’ARNm linéaire. Par conséquent, les vaccins circARN peuvent induire des réponses immunitaires adéquates, même à faibles doses.

En outre, certains chercheurs pensent que les vaccins à ARNcirc, en tant qu’ARNm de nouvelle génération, pourraient devenir des outils efficaces à l’avenir pour lutter contre les maladies virales/bactériennes courantes et les principales maladies infectieuses émergentes, ainsi que pour le traitement du cancer et d’autres maladies.

CircRNA dans la thérapie CAR / TCR-T

En tant que pionnier dans le domaine de l'ARN circulaire, ORNA a développé une thérapie par récepteur d'antigène chimérique (CAR) in situ pour une thérapie in situ qui utilise l'ORN-101, un ARN circulaire encapsulé dans le LNP, pour moduler les cellules immunitaires des patients. ORN-101 présente une haute expression du CAR pilotée par un élément IRES optimisé. Dans des modèles animaux, il a été démontré que l'ORN-101 induit la suppression et la destruction de tumeurs, ce qui suggère que les thérapies anticancéreuses basées sur l'ORN-101 peuvent interférer avec la thérapie cellulaire CAR-T conventionnelle.

De plus, Zhang et al. évalué la viabilité et l'efficacité thérapeutique des circRNA dans les thérapies du récepteur des cellules T (TCR)-T spécifiques de l'antigène. Ils ont conçu un circRNA codant pour pp65-TCR-T ciblant l’épitope pp65 du cytomégalovirus (CMV). De plus, il a été démontré que pp65-TCR est exprimé sur les cellules T primaires pendant plus de 7 jours. De plus, les cellules circRNA-pp65-TCR-T ont tué spécifiquement et systématiquement les cellules tumorales exprimant pp65 et HLA et ont considérablement prolongé la durée de survie des souris.

Il a également été démontré que les cellules transfectées avec le circRNA pp65 présentaient de meilleures réponses immunitaires par rapport à l’ARNm linéaire.