Synthèse in vitro d'ARNm
Les principaux composants de l'ARNm sont le 5'-cap, le 5'-UTR, le cadre de lecture ouvert (ORF), le 5'-UTR et la queue 5' poly A, qui sont essentiels au maintien de la fonction de l'ARNm. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodes pour identifier et optimiser les séquences et les structures d’ARNm.
La synthèse de l'ARNm est réalisée sur la base d'une transcription in vitro (IVT) à l'aide de matrices d'ADN linéaires, d'ARN polymérases (T3, T7 ou SP6), de nucléotides non modifiés ou modifiés, d'enzymes et de réactifs appropriés.
Modification du capuchon de 5'
Les séquences d'ARNm matures d'eucaryocytes présentent une coiffe de 7-méthylguanosine (m7G) à l'extrémité 5', ce qui améliore la stabilité de l'ARNm et l'efficacité de la traduction. Il existe deux méthodes générales pour capturer l’ARNm in vitro. Premièrement, l'ARNm peut être coiffé avec la transcription in vitro en ajoutant un analogue de capuchon de la structure m7GpppG (par exemple, CleanCap) au système IVT. Cette méthode de coiffage co-transcriptionnel fournit une structure de capsule naturelle en 5' et augmente l'efficacité du coiffage à près de 90 à 99 %. Deuxièmement, la cartographie de l'ARNm peut également être réalisée en cartographiant les réactions enzymatiques suite à la réaction de transcription in vitro.
Modification PolyA
La queue Poly(A) prolonge également la demi-vie de l’ARNm in vivo et améliore l’efficacité de la traduction de l’ARNm. La longueur de la queue poly(A) amplifiée doit être comprise entre 100 et 300 nucléotides. De plus, l'adénosine modifiée augmente la stabilité de la queue poly A contre la dégradation de la RNase cellulaire. La queue poly A peut être insérée par transcription in vitro à l'aide d'une matrice d'ADN codant pour poly A, ce qui donne une longueur de séquence poly A spécifique. La poly A polymérase recombinante peut également être utilisée par polyadénylation enzymatique après transcription de l'ARNm.
Modification des nucléotides
Les nucléosides modifiés peuvent inhiber la reconnaissance et/ou l’activation des récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) et améliorer l’efficacité des vaccins à ARNm de deux manières totalement différentes. L'ajout de certains nucléosides chimiquement modifiés, notamment la pseudouridine (ψ), la 1-méthylpseudouridine (m1ψ), la thiouridine (s4U) et la 5-méthylcytosine (m5C), peut empêcher l'activation du TLR7/8 et d'autres récepteurs immunitaires innés, ce qui réduit considérablement l'immunogénicité. d'ARNm.
Système de distribution d'ARNm
Pour maintenir la fonction de l’ARNm, il doit pénétrer dans le cytoplasme de l’hôte et exprimer des antigènes spécifiques. L'un des défis les plus difficiles auxquels sont confrontés les vaccins et les thérapies à ARNm réside dans la délivrance de l'ARNm dans des cellules cibles avec des niveaux de traduction suffisamment élevés, car cela nécessite des systèmes de délivrance d'ARNm hautement spécifiques et efficaces. Plusieurs vecteurs de délivrance d'ARNm ont été développés et utilisés, notamment les cellules dendritiques (DC), la protamine, les polymères cationiques et les liposomes cationiques.
Les complexes de lipides cationiques avec l'ARNm et d'autres préparations peuvent former collectivement des nanoparticules d'une taille de 80 à 200 nm appelées nanoparticules lipidiques (LNP). En tant que l'un des systèmes de délivrance d'ARNm les plus avancés, le LNP comprend des lipides cationiques ionisables, des phospholipides naturels, du cholestérol et du polyéthylène glycol (PEG). Plusieurs vaccins et thérapies à ARN (ARNsi et ARNm) approuvés par la Food and Drug Administration des États-Unis sont basés sur des systèmes d'administration LNP.
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