Циркулярные РНК (circRNAs) впервые были обнаружены как небелковокодирующие РНК в 1979 году; только в 2015 году транскрибированные circRNAs были найдены у дрозофилы, что привело к изучению in vitro circRNAs с терапевтической и профилактической целью.
circRNAs саморасширяются и поэтому не имеют традиционной структуры, такой как 5' кап или 3' полия хвост. Эта структура делает их более устойчивыми и резистентными к экзонуклеазам, таким как RNase R.
Структурные элементы циркулярной РНК (circRNA)
ДНК-шаблон для синтеза circRNA обычно включает внутрисоматический сайт входа рибосомы (IRES), открытый рамочный фрагмент (ORF) и другие элементы, критически важные для in vitro циркуляции. Например, мы разработали плазмиду как шаблон для in vitro транскрипции, которая состоит из гомологичных участков, 3’ интрона, 3’ экзона, IRES, ORF, 5’ экзона и 5’ интрона, чтобы приготовить circRNA методами самосплайсинга.
Внутренний сайт входа рибосомы (IRES) выполняет важные функции в трансляции цирРНК. IRES энцефаломиокардитного вируса (EMCV), IRES коксакиевируса B3 (CVB3), IRES человеческого риновируса B3 (HRV-B3) и другие IRES часто используются для трансляции in vitro синтеза цирРНК.
Циклизация in vivo линейных предшественников circRNA представляет собой важный этап синтеза circRNA, обычно через химические, ферментативные и рибосомно-медиаторные пути самовоспроизведения. Известный как веха в этой области, химический метод производства circRNA, возникший в 1988 году, больше не используется сегодня из-за высокой стоимости, низкой выходной производительности, большого количества побочных продуктов и того факта, что он подходит только для циклизации РНК длиной до 70 нуклеотидов.
Энзимные методы циклизации РНК основаны на ферментах бактериофага T4 или рибозимах, таких как лигаза ДНК T4 (T4 Dnl 1), лигаза РНК T4 1 (T4 Rnl 1) и лигаза РНК T4 2 (T4 Rnl 2). Для образования циркулярной РНК с использованием ферментов бактериофага T4 нуклеозидмонофосфаты должны находиться на 5' конце и соединяться с группой OH на 3' конце РНК. Поскольку нуклеозидтрифосфаты добавляются в процессе реакции, транскрипция in vitro (IVT) РНК содержит гуанозинтрифосфат (GTP) на 5’ конце.
Рибозимы — это последовательности РНК, которые способствуют самоперестройке, преобразуя линейные молекулы РНК в циркулярную РНК без необходимости использования дополнительных ферментов. Самосборный процесс включает две последовательные трансэстерификационные реакции на определённых участках для обеспечения образования желаемых продуктов cirRNA. Метод самоперестройки группы I интронов, также известный как PIE (инкапсуляция интрона и экстрона), который позволяет производить cirRNA длиной более 5 кб, был широко изучен и показал свою полезность.
Применение циркулярной РНК (circRNA)
Вакцины на основе circRNA
Подобно линейным мРНК, циркулярные РНК могут преобразовываться в определённые белки в целевых клетках и вызывать сильный гуморальный и клеточный иммунитет. Недавно некоторые исследовательские группы успешно разработали вакцины на основе circRNA для профилактики COVID-19. Их результаты не только обладают преимуществами вакцин на основе линейной мРНК, но и демонстрируют лучшую стабильность и более длительное время выражения белков по сравнению с линейной мРНК. Таким образом, вакцины на основе circRNA могут вызывать достаточные иммунные ответы даже при низких дозах.
Кроме того, некоторые исследователи считают, что вакцины на основе circRNA, как следующее поколение мРНК, могут стать эффективными инструментами в будущем для борьбы с распространенными вирусными/бактериальными заболеваниями и основными новыми инфекционными болезнями, а также для лечения рака и других заболеваний.
Циркулярная РНК в терапии CAR/TCR-T
Как пионер в области круговой РНК, ORNA разрабатывает терапию химерными антигенными рецепторами (CAR) in situ для лечения на месте с использованием ORN-101, капсулированной в ЛНП круговой РНК, для модуляции иммунных клеток у пациентов. У ORN-101 наблюдается высокое выражение CAR, управляемое оптимизированным элементом IRES. На животных моделях было показано, что ORN-101 вызывает подавление и разрушение опухолей, что предполагает, что антивирусные терапии на основе ORN-101 могут конкурировать с традиционной терапией CAR-T клетками.
Кроме того, Чжан и коллеги оценили жизнеспособность и терапевтическую эффективность круговых РНК в терапиях T-клеточными рецепторами (TCR), специфичными к антигенам. Они спроектировали круговую РНК, кодирующую pp65-TCR-T, направленную против эпитопа pp65 цитомегаловируса (CMV). Кроме того, было продемонстрировано, что pp65-TCR выражается на первичных Т-клетках более 7 дней. К тому же, circRNA-pp65-TCR-T клетки специфически и последовательно уничтожали опухолевые клетки, экспрессирующие pp65 и HLA, значительно увеличивая продолжительность жизни мышей.
Также было показано, что клетки, трансфектированные pp65 circRNA, демонстрируют более эффективные иммунные ответы по сравнению с линейной mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma Комплексное решение CRDMO для длинноцепочечной RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
