In vitro syntéza mRNA
Hlavnými zložkami mRNA sú 5'-cap, 5'-UTR, otvorený čítací rámec (ORF), 5'-UTR a 5' poly A koniec, ktoré sú nevyhnutné na udržanie funkcie mRNA. Výskumníci použili rôzne metódy na identifikáciu a optimalizáciu sekvencií a štruktúr mRNA.
Syntéza mRNA sa uskutočňuje na základe in vitro transkriptu (IVT) pomocou lineárnych templátov DNA, RNA polymeráz (T3, T7 alebo SP6), nemodifikovaných alebo modifikovaných nukleotidov, enzýmov a vhodných činidiel.
5' Modifikácia uzáveru
Sekvencie zrelej mRNA z eukaryocytov vykazujú 7-metylguanozínový (m7G) uzáver na 5' konci, čo zlepšuje stabilitu mRNA a translčnú účinnosť. Existujú dva všeobecné spôsoby zachytenia mRNA in vitro. Po prvé, mRNA môže byť uzatvorená spolu s in vitro transkriptom pridaním cap analógu štruktúry m7GpppG (napr. CleanCap) do IVT systému. Táto ko-transkripčná metóda uzatvárania poskytuje prirodzenú štruktúru 5' kapsuly a zvyšuje účinnosť uzatvárania na takmer 90-99 %. Po druhé, mapovanie mRNA sa môže uskutočniť aj mapovaním enzýmových reakcií po in vitro transkripčnej reakcii.
Modifikácia PolyA
Poly(A) chvost tiež predlžuje polčas mRNA in vivo a zlepšuje účinnosť translácie mRNA. Dĺžka amplifikovaného poly(A) chvosta by mala byť 100-300 nukleotidov. Okrem toho modifikovaný adenozín zvyšuje stabilitu poly A chvosta proti degradácii bunkovej RNázy. Poly A chvost môže byť vložený in vitro transkripciou s použitím DNA templátu kódujúceho poly A, čo vedie k špecifickej dĺžke poly A sekvencie. Rekombinantná poly A polymeráza môže byť tiež použitá enzymatickou polyadenyláciou po transkripcii mRNA.
Modifikácia nukleotidov
Modifikované nukleozidy môžu inhibovať rozpoznávanie a/alebo aktiváciu receptorov rozpoznávania vzoru (PRR) a zvyšovať účinnosť mRNA vakcín dvoma úplne odlišnými spôsobmi. Pridanie určitých chemicky modifikovaných nukleozidov vrátane pseudouridínu (ψ), 1-metylpseudouridínu (m1ψ), tiouridínu (s4U) a 5-metylcytozínu (m5C) môže zabrániť aktivácii TLR7/8 a iných vrodených imunitných receptorov, ktoré významne znižujú imunogenicitu mRNA.
mRNA dodávací systém
Na udržanie funkcie mRNA potrebuje vstúpiť do hostiteľskej cytoplazmy a exprimovať špecifické antigény. Jedna z najťažších výziev, ktorým čelia mRNA vakcíny a terapeutiká, spočíva v dodaní mRNA do cieľových buniek s dostatočne vysokými hladinami translácie, pretože si to vyžaduje vysoko špecifické a účinné systémy na dodávanie mRNA. Bolo vyvinutých a použitých niekoľko vektorov na dodávanie mRNA, vrátane dendritických buniek (DC), protamínu, katiónových polymérov a katiónových lipozómov.
Komplexy katiónových lipidov s mRNA a inými prípravkami môžu spoločne vytvárať nanočastice s veľkosťou 80 až 200 nm nazývané lipidové nanočastice (LNP). Ako jeden z najmodernejších systémov dodávania mRNA obsahuje LNP ionizovateľné katiónové lipidy, prírodné fosfolipidy, cholesterol a polyetylénglykol (PEG). Niekoľko RNA vakcín a terapií (siRNA a mRNA) schválených US Food and Drug Administration je založených na systémoch dodávania LNP.
Yaohai Bio-Pharma ponúka jednorazové riešenie pre RNA
Vlastné dodávky
|
Stupeň
|
dodávky
|
špecifikácia
|
použitie
|
|
non-GMP
|
Liečivo, mRNA
|
0.1 až 10 mg (mRNA)
|
Predklinický výskum, ako je bunková transfekcia, vývoj analytických metód, predstabilizačné štúdie, vývoj formulácií
|
|
Liekový produkt, LNP-mRNA
|
|
GMP, sterilita
|
Liečivo, mRNA
|
10 mg až 70 g
|
Výskumný nový liek (IND), Povolenie na klinické skúšanie (CTA), Dodávka klinickej skúšky, Žiadosť o biologickú licenciu (BLA), Komerčná dodávka
|
|
Liekový produkt, LNP-mRNA
|
5000 injekčných liekoviek alebo naplnených injekčných striekačiek/náplní
|
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
