Kruhové RNA (circRNA) boli prvýkrát objavené ako nekódujúce RNA v roku 1979; až v roku 2015 sa našli transkribované circRNA u Drosophila, čo viedlo k štúdiu in vitro circRNA na terapeutické a preventívne účely.
circRNA sú samoexpandujúce, a preto nemajú konvenčnú štruktúru, ako je 5' čiapočka alebo 3' polyA chvost. Táto štruktúra ich robí stabilnejšími a odolnejšími voči exonukleázam, ako je RNáza R.
Štruktúrne prvky kruhovej RNA (circRNA)
Templátová DNA pre syntézu circRNA typicky zahŕňa interné ribozómové vstupné miesto (IRES), otvorený čítací rámec (ORF) a ďalšie, ktoré sú kritické pre in vitro cirkuláciu. Napríklad sme navrhli plazmid ako in vitro transkriptový (IVT) templát, ktorý pozostáva z homologických ramien, 3' intrónu, 3' exónu, IRES, ORF, 5' exónu a 5' intrónu, na prípravu circRNA samozostrihom. metódy.
Internal Ribosome Entry Site (IRES) plní dôležité úlohy pri translácii cirRNA. Vírus encefalomyokarditídy (EMCV) IRES, koxsackievírus B3 (CVB3) IRES, ľudský rinovírus B3 (HRV-B3) IRES a ďalšie IRES sa bežne používajú na transláciu syntézy cirRNA in vitro
In vivo cyklizácia lineárnych prekurzorov circRNA poskytuje dôležitý krok v syntéze circRNA, zvyčajne prostredníctvom chemických, enzymatických a ribozómami sprostredkovaných autoreplikačných dráh. Chemický prístup k produkcii circRNA, známy ako míľnik v tejto oblasti, vznikol v roku 1988, sa dnes už nepoužíva z dôvodu vysokej ceny, nízkeho výťažku, vysokého počtu vedľajších produktov a skutočnosti, že je vhodný len na cyklizáciu. RNA s dĺžkou až 70 nukleotidov.
Enzymatické metódy na cyklizáciu RNA sú založené na bakteriofágových T4 enzýmoch alebo ribozýmoch, ako je T4 DNA ligáza (T4 Dnl 1), T4 RNA ligáza 1 (T4 Rnl 1) a T4 RNA ligáza 2 (T4 Rnl 2). Na vytvorenie kruhovej RNA pomocou T4 bakteriofágových enzýmov musia byť nukleozidové monofosfáty umiestnené na 5' konci a konjugované s OH skupinou na 3' konci RNA. Pretože sa počas reakcie pridávajú nukleozidtrifosfáty, IVT RNA obsahuje guanozíntrifosfát (GTP) na 5' konci.
Ribozýmy sú sekvencie RNA, ktoré podporujú samozostrih konvertovaním lineárnych molekúl RNA na circRNA bez potreby ďalších enzýmov. Proces samozostavenia zahŕňa dve po sebe idúce transesterifikačné reakcie na špecifických miestach, aby sa zabezpečilo, že sa vytvoria požadované produkty cirRNA. Metóda samozostrihu intrónov skupiny I, tiež známa ako PIE (zapuzdrenie intrónov a exónov), ktorá umožňuje produkciu cirRNA dlhších ako 5 kb, bola rozsiahlo študovaná a osvedčila sa.
Aplikácia kruhovej RNA (circRNA)
Vakcíny CircRNA
Podobne ako lineárne mRNA, aj circRNA sa môžu v cieľových bunkách premeniť na určité proteíny a vyvolať silnú humorálnu a bunkovú imunitu. Nedávno existuje niekoľko výskumných tímov, ktoré úspešne vyvinuli circRNA vakcíny na prevenciu COVID-19. Ich výsledky majú nielen výhody lineárnych mRNA vakcín, ale môžu sa pochváliť aj lepšou stabilitou a dlhším trvaním proteínovej expresie ako lineárna mRNA. Preto môžu circRNA vakcíny indukovať adekvátne imunitné reakcie aj pri nízkych dávkach.
Niektorí výskumníci si navyše myslia, že vakcíny circRNA ako mRNA novej generácie sa môžu v budúcnosti stať účinnými nástrojmi na boj proti bežným vírusovým/bakteriálnym ochoreniam a hlavným vznikajúcim infekčným ochoreniam, ako aj na liečbu rakoviny a iných ochorení.
CircRNA v terapii CAR / TCR-T
Ako priekopník v oblasti cirkulárnej RNA vyvíja ORNA in situ terapiu chimerickým antigénovým receptorom (CAR) pre in situ terapiu, ktorá využíva s ORN-101, LNP-zapuzdrenú kruhovú RNA, na moduláciu imunitných buniek u pacientov. ORN-101 predstavuje vysokú expresiu CAR poháňanú optimalizovaným prvkom IRES. Na zvieracích modeloch sa ukázalo, že ORN-101 indukuje supresiu a deštrukciu nádoru, čo naznačuje, že protirakovinové terapie založené na ORN-101 môžu interferovať s konvenčnou terapiou CAR-T bunkami.
Okrem toho Zhang a kol. hodnotili životaschopnosť a terapeutickú účinnosť circRNA v terapiách s antigén-špecifickým T-bunkovým receptorom (TCR)-T. Navrhli circRNA kódujúcu pp65-TCR-T zacielenú na pp65 epitop cytomegalovírusu (CMV). Okrem toho sa ukázalo, že pp65-TCR je exprimovaný na primárnych T bunkách počas viac ako 7 dní. Okrem toho bunky circRNA-pp65-TCR-T špecificky a konzistentne zabíjali nádorové bunky exprimujúce pp65 a HLA a významne predĺžili čas prežitia myší.
Ukázalo sa tiež, že bunky transfekované pp65 circRNA vykazovali lepšie imunitné reakcie v porovnaní s lineárnou mRNA.
Riešenie Yaohai Bio-Pharma One-Stop CRDMO pre dlho kódujúcu RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
