Kruhové RNA (circRNA) boli poprvýkrát objavené ako nenabíjecí RNA v roku 1979; až v roku 2015 sa však našli transkribované circRNA v drozofílach, čo viedlo k štúdiu in vitro circRNA s cieľom liečby a prevencie.
circRNA sú samorozbíhavé a preto nemajú konvenčnú štruktúru, ako je 5' kapka alebo 3' polyA chvost. Táto štruktúra ich robí stabilnejšími a odolnejšími voči exonukleázam, ako je RNase R.
Štrukturálne prvky kruhovej RNA (circRNA)
DNA šablóna na syntézu circRNA obvykle obsahuje interný ribozomálny vstupný bod (IRES), otvorenú čtecnu rámu (ORF) a iné prvky, ktoré sú kritické pre in vitro cirkuláciu. Napríklad, navrhli sme plazmid ako šablónu pre in vitro transkripciu (IVT), ktorý sa skladá z homologických ramien, 3’ intron, 3’ exon, IRES, ORF, 5’ exon a 5’ intron, aby sa pripravila circRNA metódami samosplicingu.
Interný ribozomálny vstupný bod (IRES) vykonáva dôležité úlohy pri preklade cirRNAs. IRES z vírusu encefalomyokarditídy (EMCV) IRES, IRES z vírusa coxsackievirus B3 (CVB3), IRES z ľudského rínoviru B3 (HRV-B3) a iné IRES sa bežne používajú pre preklad in vitro syntézy cirRNAs.
In vivo cykličnosť lineárnych predchodcov circRNA tvorí dôležitý krok v syntéze circRNA, obvykle cez chemické, enzymatické a ribozomovo medziaté samovynásobenie. Chemická metóda na produkciu circRNA, poznáma ako milník v tejto oblasti, pôvodne zavedená v roku 1988, už dnes nie je používaná kvôli jej vysokým nákladom, nízkej výdajnosti, veľkému množstvu vedľajších produktov a tomu, že je vhodná len na cyklikovanie RNA s dĺžkou až 70 nukleotidov.
Enzymatické metódy na cyklikovanie RNA sú založené na bakteriofágových T4 enzymoch alebo ribozomoch, ako sú T4 DNA ligáza (T4 Dnl 1), T4 RNA ligáza 1 (T4 Rnl 1) a T4 RNA ligáza 2 (T4 Rnl 2). Na tvorbu cirkuľnej RNA pomocou T4 bakteriofágových enzymov musia byť nukleozidné monofosfáty umiestnené na 5' konci a spojené s OH skupinou na 3' konci RNA. Pretože sa počas reakcie pridávajú nukleozidné triofosfáty, IVT RNA obsahuje guanínový triofosfát (GTP) na 5' konci.
Ribozomy sú postupy RNA, ktoré podporujú samo-spájanie konvertovaním lineárnych RNA molekúl na circRNA bez potreby dodatočných enzymov. Proces samo-spojovania zahŕňa dve po sebe idúcich transesterifikačných reakcií na špecifických miestach, aby sa zaistilo vytvorenie požadovaných produktov cirRNA. Metóda samo-spájania skupiny I intronov, tiež známa ako PIE (inkapzulácia intronov a exonov), ktorá umožňuje výrobu circRNA dlhšie ako 5 kb, bola detailne študovaná a ukázala sa ako užitočná.
Aplikácia kruhovej RNA (circRNA)
CircRNA vakcíny
Podobne ako lineárne mRNA, circRNA sa môžu previesť na určité proteíny v cieľových bunkách a indukovať silnú humoralnú a bunecnú imunitu. Nedávno niekoľko výskumných tímov úspešne vyvinulo circRNA vakcíny na prevenciu COVID-19. Ich výsledky ne len zachovali výhody lineárnych mRNA vakcín, ale tiež ukázali lepšiu stabilitu a dlhšiu dobu expresie proteínov ako lineárne mRNA. Preto môžu circRNA vakcíny indukovať dostatočné imunitné odpovede aj pri nízkych dávkach.
Okrem toho niektorí výskumníci považujú circRNA vakčiny za ďalšiu generáciu mRNA, ktoré v budúcnosti môžu byť efektívnymi nástrojmi na boj proti bežným vírusovým/bakteriálnym chorobám a hlavným novým infekčným chorobám, ako aj na liečbu rakoviny a iných chorôb.
CircRNA v CAR/TCR-T terapii
Jako predchádzajúci v oblasti kruhového RNA, ORNA vyvíja terapiu in situ chimerickým antigenovým receptorom (CAR) pre lokálnu terapiu, ktorá využíva ORN-101, kruhový RNA zabalovaný do LNP, na moduláciu imunitných buniek u pacientov. ORN-101 prejavuje vysoké výrazenie CAR ovládané optimalizovaným elementom IRES. V živočíchnych modeloch sa ukázalo, že ORN-101 spôsobuje potlačenie a ničenie nádorov, čo naznačuje, že ORN-101 zakotvené protinádorové terapie môžu interferovať s konvenčnou terapiou CAR-T bunkami.
Okrem toho hodnotili Zhang a spol. životnoschopnosť a liečebnú účinnosť circRNA v antigenovo špecifických T-bunkách receptorov TCR (TCR)-T. Navrhli circRNA kodujúce pp65-TCR-T cieľovo namierené na epitop pp65 cytomegalovirusu (CMV). Okrem toho bolo ukázané, že pp65-TCR je vyjadrené na primárnych T bunkách viac ako 7 dní. Okrem toho specificky a konzistentne likvidovali circRNA-pp65-TCR-T bunky tumorové bunky vyjadrujúce pp65 a HLA a významne predĺžili prežitie myši.
Bolo tiež ukázané, že bunky transfikované s pp65 circRNA vykazovali lepšie imunitné odpovede v porovnaní s lineárnym mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma Komplexné CRDMO Riešenie pre Dlhodobé Kódovanie RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
