Los ARN circulares (circRNA) se descubrieron por primera vez como ARN no codificantes en 1979; No fue hasta 2015 que se encontraron circRNA transcritos en Drosophila, lo que llevó al estudio de circRNA in vitro con fines terapéuticos y preventivos.
Los circRNA son autoexpandibles y, por lo tanto, no tienen una estructura convencional como una tapa 5' o una cola poliA 3'. Esta estructura los hace más estables y resistentes a exonucleasas como la RNasa R.
Elementos estructurales del ARN circular (ARNcirc)
El ADN molde para la síntesis de circRNA generalmente incluye un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES), un marco de lectura abierto (ORF) y otros que son críticos para la circulación in vitro. Por ejemplo, diseñamos un plásmido como plantilla de transcripción in vitro (IVT), que consta de brazos de homología, intrón 3', exón 3', IRES, ORF, exón 5' e intrón 5', para preparar ARNcirc mediante autoempalme. métodos.
El sitio de entrada de ribosomas internos (IRES) desempeña funciones importantes en la traducción de cirRNA. El IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), el IRES del virus coxsackie B3 (CVB3), el IRES del rinovirus humano B3 (HRV-B3) y otros IRES se han utilizado comúnmente para la traducción de la síntesis in vitro de ARNcir.
La ciclación in vivo de precursores lineales de circRNA proporciona un paso importante en la síntesis de circRNA, generalmente a través de vías de autorreplicación químicas, enzimáticas y mediadas por ribosomas. Conocido como un hito en el campo, el enfoque químico para la producción de circRNA, originado en 1988, ya no se utiliza hoy en día debido a su alto costo, bajo rendimiento, gran cantidad de subproductos y al hecho de que solo es adecuado para ciclación. ARN de hasta 70 nucleótidos de longitud.
Los métodos enzimáticos para ciclar el ARN se basan en enzimas o ribozimas del bacteriófago T4, como la ADN ligasa T4 (T4 Dnl 1), la ARN ligasa T4 1 (T4 Rnl 1) y la ARN ligasa T4 2 (T4 Rnl 2). Para formar ARN circular mediante enzimas del bacteriófago T4, los nucleósidos monofosfato deben ubicarse en el extremo 5' y conjugarse con el grupo OH en el extremo 3' del ARN. Debido a que se agregan nucleósidos trifosfato durante la reacción, el ARN IVT contiene trifosfato de guanosina (GTP) en el extremo 5'.
Las ribozimas son secuencias de ARN que promueven el autoempalme al convertir moléculas de ARN lineales en ARN circular sin necesidad de enzimas adicionales. El proceso de autoensamblaje implica dos reacciones de transesterificación consecutivas en sitios específicos para garantizar que se formen los productos de ARNcir deseados. El método de autoempalme de intrones del grupo I, también conocido como PIE (encapsulación de intrones y exones), que permite la producción de ARNcir de más de 5 kb, ha sido ampliamente estudiado y ha demostrado ser útil.
Aplicación del ARN circular (circRNA)
Vacunas de ARN circular
Al igual que los ARNm lineales, los ARNcirc pueden convertirse en determinadas proteínas en las células diana e inducir una inmunidad humoral y celular sólida. Recientemente, hay algunos equipos de investigación que desarrollaron con éxito vacunas de ARN circular para prevenir el COVID-19. Sus resultados no solo han poseído los beneficios de las vacunas de ARNm lineal, sino que también cuentan con una mejor estabilidad y una mayor duración de la expresión de proteínas que el ARNm lineal. Por tanto, las vacunas circRNA pueden inducir respuestas inmunitarias adecuadas incluso en dosis bajas.
Además, algunos investigadores creen que las vacunas circRNA, como ARNm de próxima generación, pueden convertirse en herramientas eficaces en el futuro para combatir enfermedades virales/bacterianas comunes y las principales enfermedades infecciosas emergentes, así como para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
CircRNA en la terapia CAR / TCR-T
Como pionero en el campo del ARN circular, ORNA ha estado desarrollando una terapia con receptor de antígeno quimérico (CAR) in situ que utiliza ORN-101, un ARN circular encapsulado en LNP, para modular las células inmunitarias en pacientes. ORN-101 presenta una alta expresión del CAR impulsado por un elemento IRES optimizado. En modelos animales, se demostró que ORN-101 induce la supresión y destrucción de tumores, lo que sugiere que las terapias contra el cáncer basadas en ORN-101 pueden interferir con la terapia convencional con células CAR-T.
Además, Zhang et al. evaluó la viabilidad y eficacia terapéutica de los ARNcirc en terapias con receptores de células T (TCR) -T específicos de antígeno. Diseñaron un circRNA que codifica pp65-TCR-T dirigido al epítopo pp65 del citomegalovirus (CMV). Además, se ha demostrado que pp65-TCR se expresa en células T primarias durante más de 7 días. Además, las células circRNA-pp65-TCR-T mataron de manera específica y consistente las células tumorales que expresan pp65 y HLA y extendieron significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones.
También se demostró que las células transfectadas con circRNA pp65 exhibieron mejores respuestas inmunes en comparación con el ARNm lineal.
Solución CRDMO integral de Bio-Pharma de Yaohai para ARN de codificación larga
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