Síntesis in vitro de mRNA
Los componentes principales del mRNA son el 5'-cap, el 5'-UTR, el marco de lectura abierto (ORF), el 3'-UTR y la cola poli-A, los cuales son esenciales para mantener la función del mRNA. Los investigadores han utilizado una variedad de métodos para identificar y optimizar las secuencias y estructuras del mRNA.
La síntesis de mRNA se lleva a cabo basándose en un transcrito in vitro (IVT) utilizando plantillas de ADN lineal, polimerasas de ARN (T3, T7 o SP6), nucleótidos no modificados o modificados, enzimas y reactivos apropiados.
modificación del 5' Cap
Las secuencias de ARN maduro de eucariotas presentan una tapa de 7-metilguanosina (m7G) en el extremo 5', lo que mejora la estabilidad del ARN y la eficiencia de traducción. Hay dos métodos generales para capturar ARN en vitro. En primer lugar, el ARN puede ser taponado junto con el transcrito in vitro añadiendo un análogo de tapón de estructura m7GpppG (por ejemplo, CleanCap) al sistema IVT. Este método de tapado co-transcripcional proporciona una estructura natural de cápsula en el extremo 5' y aumenta la eficiencia de tapado hasta casi el 90-99%. En segundo lugar, también se puede realizar el mapeo del ARN mediante reacciones enzimáticas de mapeo después de la transcripción in vitro.
Modificación PolyA
La cola poli(A) también extiende la vida media del mRNA en vivo y mejora la eficiencia de traducción del mRNA. La longitud de la cola poli(A) amplificada debe ser de 100-300 nucleótidos. Además, la adenosina modificada aumenta la estabilidad de la cola poli A contra la degradación por RNasas celulares. La cola poli A puede insertarse mediante la transcripción in vitro utilizando una plantilla de ADN que codifique para poli A, lo que resulta en una longitud específica de la secuencia poli A. También se puede utilizar polimerasa poli A recombinante para realizar la poliadenilación enzimática después de la transcripción del mRNA.
Modificación de nucleótidos
Los nucleósidos modificados pueden inhibir el reconocimiento y/o activación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y mejorar la eficacia de las vacunas de ARNm de dos maneras completamente diferentes. La adición de ciertos nucleósidos químicamente modificados, incluyendo pseudouridina (ψ), 1-metilpseudouridina (m1ψ), tiouridina (s4U) y 5-metilcitosina (m5C), puede prevenir la activación de TLR7/8 y otros receptores inmunológicos innatos, lo que reduce significativamente la inmunogenicidad del ARNm.
sistema de Entrega de ARNm
Para mantener la función del ARNm, este necesita entrar en el citoplasma del huésped y expresar antígenos específicos. Uno de los mayores desafíos que enfrentan las vacunas y terapias de ARNm radica en entregar el ARNm a las células objetivo con niveles de traducción suficientemente altos, lo que requiere sistemas de entrega de ARNm muy específicos y eficientes. Se han desarrollado y utilizado varios vectores de entrega de ARNm, incluidas las células dendríticas (DCs), protamina, polímeros catiónicos y liposomas catiónicos.
Los complejos de lípidos cationicos con mRNA y otras preparaciones pueden formar colectivamente nanopartículas de 80-200 nm de tamaño llamadas nanopartículas lipídicas (LNPs). Como uno de los sistemas de entrega de mRNA más avanzados, el LNP incluye lípidos cationicos ionizables, fosfolípidos naturales, colesterol y polietilenglicol (PEG). Varias vacunas de RNA y terapias (siRNA y mRNA) aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. se basan en sistemas de entrega de LNP.
Yaohai Bio-Pharma Ofrece Solución Integral para RNA
Entregables Personalizados
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Grado
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Entregables
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Especificación
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Aplicaciones
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no-GMP
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Sustancia Farmacéutica, mRNA
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0,1~10 mg (mRNA)
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Investigación preclínica como la transfección celular, desarrollo de métodos analíticos, estudios de pre-estabilidad, desarrollo de formulación
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Producto farmacéutico, LNP-mRNA
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GMP, Esterilidad
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Sustancia Farmacéutica, mRNA
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10 mg~70 g
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Investigational new drug (IND), Autorización de ensayo clínico (CTA), Suministro de ensayos clínicos, Solicitud de licencia biológica (BLA), Suministro comercial
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Producto farmacéutico, LNP-mRNA
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5000 frascos o jeringas precargadas/ cartuchos
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