Los RNAs circulares (circRNAs) fueron descubiertos por primera vez como RNAs no codificantes en 1979; no fue hasta 2015 que se encontraron circRNAs transcritas en Drosophila, lo que llevó al estudio de circRNAs in vitro con fines terapéuticos y preventivos.
los circRNAs son autoreplicantes y, por lo tanto, no tienen una estructura convencional como un cap 5' o una cola poliA 3'. Esta estructura los hace más estables y resistentes a las exonucleasas como la RNasa R.
Elementos Estructurales del RNA Circular (circRNA)
El ADN plantilla para la síntesis de circRNA generalmente incluye sitios de entrada ribosómica interna (IRES), marco de lectura abierto (ORF) y otros que son críticos para la circulación in vitro. Por ejemplo, diseñamos un plásmido como plantilla de transcrito in vitro (IVT), que consta de brazos de homología, intrón 3', exón 3', IRES, ORF, exón 5' e intrón 5', para preparar circRNA mediante métodos de autocorte.
El Sitio de Entrada Interna de Ribosoma (IRES) desempeña roles importantes en la traducción de cirRNAs. El IRES del virus de la encefalomiotocarditis (EMCV), el IRES del coxsackievirus B3 (CVB3), el IRES del rinovirus humano B3 (HRV-B3) y otros IRES han sido comúnmente utilizados para la traducción de la síntesis in vitro de cirRNAs.
La ciclización in vivo de precursores lineales de circRNA proporciona un paso importante en la síntesis de circRNA, generalmente a través de vías químicas, enzimáticas y de autoreplicación mediada por ribosomas. Conocida como un hito en el campo, el enfoque químico para la producción de circRNA, originado en 1988, ya no se utiliza hoy en día debido a su alto costo, baja rendimiento, gran cantidad de subproductos y al hecho de que solo es adecuado para ciclizar RNAs de hasta 70 nucleótidos de longitud.
Los métodos enzimáticos para ciclizar ARN se basan en enzimas de bacteriofago T4 o ribozimas, como la ligasa de ADN T4 (T4 Dnl 1), la ligasa de ARN T4 1 (T4 Rnl 1) y la ligasa de ARN T4 2 (T4 Rnl 2). Para formar ARN circular mediante enzimas del bacteriofago T4, los monofosfatos de nucleósidos deben estar ubicados en el extremo 5' y conjugarse con el grupo OH en el extremo 3' del ARN. Debido a que se añaden trifosfatos de nucleósidos durante la reacción, el ARN IVT contiene guanosina trifosfato (GTP) en el extremo 5’.
Los ribozimas son secuencias de ARN que promueven el autosplicing convirtiendo moléculas de ARN lineal en circRNA sin la necesidad de enzimas adicionales. El proceso de autoensamblaje implica dos reacciones consecutivas de transesterificación en sitios específicos para asegurar que se formen los productos cirRNA deseados. El método de autosplicing del intrón tipo I, también conocido como PIE (encapsulamiento de intrón y exón), que permite la producción de circRNAs mayores a 5 kb, ha sido ampliamente estudiado y ha demostrado ser útil.
Aplicación del ARN circular (circRNA)
Vacunas circRNA
Al igual que los ARNm lineales, los circRNAs pueden convertirse en ciertas proteínas en las células objetivo e inducir una robusta inmunidad humoral y celular. Recientemente, algunos equipos de investigación han desarrollado con éxito vacunas circRNA para prevenir el COVID-19. Sus resultados no solo poseen los beneficios de las vacunas de ARNm lineal, sino que también presentan una mayor estabilidad y una duración más larga de la expresión de proteínas en comparación con el ARNm lineal. Por lo tanto, las vacunas circRNA pueden inducir respuestas inmunes adecuadas incluso a bajas dosis.
Además, algunos investigadores creen que las vacunas circRNA, como las próximas generaciones de ARNm, podrían convertirse en herramientas efectivas en el futuro para combatir enfermedades virales/bacterianas comunes y enfermedades infecciosas emergentes importantes, así como para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
CircRNA en la terapia CAR / TCR-T
Como pionera en el campo del ARN circular, ORNA ha estado desarrollando terapia de receptor de antígeno quimérico (CAR) in situ para terapia in situ que utiliza el ORN-101, un ARN circular encapsulado en LNP, para modular las células inmunitarias en los pacientes. El ORN-101 presenta una alta expresión del CAR impulsada por un elemento IRES optimizado. En modelos animales, se demostró que el ORN-101 induce la supresión y destrucción del tumor, lo que sugiere que las terapias anticancerígenas basadas en ORN-101 podrían interferir con la terapia convencional de CAR-T.
Además, Zhang et al. evaluaron la viabilidad y eficacia terapéutica de los circRNAs en terapias de receptor de células T (TCR)-T específicas de antígenos. Diseñaron un circRNA que codifica pp65-TCR-T dirigido al epítopo pp65 del citomegalovirus (CMV). Además, se demostró que el pp65-TCR se expresa en células T primarias durante más de 7 días. Además, las células circRNA-pp65-TCR-T matan específicamente y consistentemente a las células tumorales que expresan pp65 y HLA y aumentan significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones.
También se demostró que las células transfectadas con pp65 circRNA mostraron mejores respuestas inmunes en comparación con el mRNA lineal.
Solución Integral de CRDMO de Bio-Farma de Yaohai para RNA de Carga Larga
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