In vitro syntéza mRNA
Hlavní složky mRNA jsou 5'-cap, 5'-UTR, otevřený čtecí rámec (ORF), 5'-UTR a 5' poly A konec, které jsou nezbytné pro udržení funkce mRNA. Výzkumníci použili různé metody k identifikaci a optimalizaci sekvencí a struktur mRNA.
Syntéza mRNA se provádí na základě in vitro transkriptu (IVT) pomocí lineárních templátů DNA, RNA polymeráz (T3, T7 nebo SP6), nemodifikovaných nebo modifikovaných nukleotidů, enzymů a vhodných činidel.
5' Modifikace uzávěru
Sekvence zralé mRNA z eukaryocytů vykazují 7-methylguanosinovou (m7G) čepičku na 5' konci, což zlepšuje stabilitu mRNA a translační účinnost. Existují dvě obecné metody pro zachycení mRNA in vitro. Za prvé, mRNA může být uzavřena spolu s in vitro transkriptem přidáním cap analogu struktury m7GpppG (např. CleanCap) do IVT systému. Tato ko-transkripční metoda uzavírání poskytuje přirozenou strukturu 5' kapsle a zvyšuje účinnost uzavření na téměř 90-99 %. Za druhé, mapování mRNA může být také provedeno mapováním enzymových reakcí po in vitro transkripční reakci.
Modifikace PolyA
Poly(A) tail také prodlužuje poločas mRNA in vivo a zlepšuje účinnost translace mRNA. Délka amplifikovaného poly(A) ocasu by měla být 100-300 nukleotidů. Navíc modifikovaný adenosin zvyšuje stabilitu poly A konce proti degradaci buněčné RNázy. Poly A konec může být vložen in vitro transkripcí s použitím DNA templátu kódujícího poly A, což vede ke specifické délce poly A sekvence. Rekombinantní poly A polymerázu lze také použít enzymatickou polyadenylací po transkripci mRNA.
Modifikace nukleotidů
Modifikované nukleosidy mohou inhibovat rozpoznávání a/nebo aktivaci receptorů rozpoznávání vzorů (PRR) a zvyšovat účinnost mRNA vakcín dvěma zcela odlišnými způsoby. Přidání určitých chemicky modifikovaných nukleosidů včetně pseudouridinu (ψ), 1-methylpseudouridinu (m1ψ), thiouridinu (s4U) a 5-methylcytosinu (m5C) může zabránit aktivaci TLR7/8 a dalších vrozených imunitních receptorů, které významně snižují imunogenicitu mRNA.
mRNA dodávací systém
K udržení funkce mRNA potřebuje vstoupit do hostitelské cytoplazmy a exprimovat specifické antigeny. Jedna z nejobtížnějších výzev, kterým čelí mRNA vakcíny a terapeutika, spočívá v dodávání mRNA do cílových buněk s dostatečně vysokou úrovní translace, protože to vyžaduje vysoce specifické a účinné systémy pro dodávání mRNA. Bylo vyvinuto a použito několik vektorů pro dodávání mRNA, včetně dendritických buněk (DC), protaminu, kationtových polymerů a kationtových lipozomů.
Komplexy kationtových lipidů s mRNA a dalšími přípravky mohou společně tvořit nanočástice o velikosti 80-200 nm nazývané lipidové nanočástice (LNP). Jako jeden z nejpokročilejších systémů dodávání mRNA zahrnuje LNP ionizovatelné kationtové lipidy, přírodní fosfolipidy, cholesterol a polyethylenglykol (PEG). Několik RNA vakcín a terapií (siRNA a mRNA) schválených US Food and Drug Administration je založeno na systémech podávání LNP.
Yaohai Bio-Pharma nabízí komplexní řešení pro RNA
Vlastní dodávky
|
Stupeň
|
Dodávky
|
specifikace
|
Aplikace
|
|
non-GMP
|
Léčivá látka, mRNA
|
0.1~10 mg (mRNA)
|
Preklinický výzkum, jako je buněčná transfekce, vývoj analytických metod, předstabilizační studie, vývoj formulací
|
|
Lékový produkt, LNP-mRNA
|
|
GMP, sterilita
|
Léčivá látka, mRNA
|
10 mg až 70 g
|
Výzkumný nový lék (IND), Povolení ke klinickému hodnocení (CTA), Dodávka klinického hodnocení, Žádost o biologickou licenci (BLA), Komerční dodávka
|
|
Lékový produkt, LNP-mRNA
|
5000 injekčních lahviček nebo předplněných injekčních stříkaček/náplní
|
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
