Vlastní syntéza saRNA
Samoozbrojující se mRNA (saRNA), také známá jako replikon RNA, kóduje sekvence in vitro transkripcí (IVT) mRNA a virální replikázy geny odvozené z alphavirů nebo flavivirů. Virální geny replikázy umožňují samoozbrojení mRNA, což vede ke zvýšenému výrazu bílkoviny a minimální požadované dávce RNA ve srovnání s neozbrojujícími se mRNA. Dalším aspektem je, že saRNA je relativně velká molekula (více než 14 kb).
Yaohai Bio-Pharma vyvinula sadu technologií pro syntézu mRNA, která poskytuje neamplifikovanou mRNA a samoopakovnou mRNA (1000 nt~14000 nt), jakožto návrh a optimalizace sekvence, IVT, čištění, lyofilizace a encapsulace do lipidových nanocastic (LNP). Všechny produkty jsou uvolňovány za přísných standardů kontroly kvality.
Obr.1 Strukturní vlastnosti IVT mRNA: Konvenční, kruhová a samoopakovná mRNA.
Sequenční vlastnosti samoopakovné mRNA
Samovzbuzovaná RNA obsahuje čtyři nestrukturní proteiny (označené jako nsP1, nsP2, nsP3 a nsP4), které pocházejí z alfavirů, konkrétně z venezuelského viru encefalitidy koní (VEEV). Mezi nimi nsP1 projevuje dvojí enzymatickou aktivitu, totiž GTase a N7MTase, zatímco nsP2 má RTPase aktivitu, což je klíčové pro zakončení IVT mRNA a vytvoření struktury Cap 0. Navíc slouží nsP2 jako proteasa a helicase, čímž usnadňuje komplexní zpracování celého nsP komplexu. Přesná funkce nsP3 zůstává nejasná, ale interaguje s různými hostitelskými buněčnými proteiny, čímž přispívá ke zmírnění antivirové odpovědi hostitele.
Region subgenomického promotoru (SGP) alfaviru se nachází před genem interesu (GOI). Prvek SGP umožňuje iniciování transkripce GOI přeskočením čtení sekvence kódující virální nestrukturní proteiny nsP.
Obr.2 Syntéza a buněčné asay eGFP saRNA na platformě RNASci Yaohai Bio-Pharma.
Vlastní řešení saRNA
Protokol syntézy saRNA je podobný mRNA: Vlastní syntéza mRNA
- Návrh sekvence
- Příprava plasmidového šablony
- transkripcese v vitro (IVT)
- enzymatické uzavírání mRNA
- kovalentní uzavírání mRNA během transkripcí
- čištění mRNA
- lyofilizace mRNA
- Encapsulation do LNP
- Analýza a testování
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
