Pokud jde o masovou produkci mRNA, je účinnější a vyspělejší metoda in vitro transkripce (IVT). IVT reakce využívá linearizovanou plazmidovou DNA obsahující promotor T7 jako templát a mRNA je syntetizována s nukleosidtrifosfáty (NTP) jako substráty v přítomnosti T7 RNA polymerázy.
Nukleotidová modifikace je průlomem ve zkoumání mRNA, kdy jsou nemodifikované molekuly mRNA rozpoznány intracelulárními RNA senzory, aby se aktivovala vrozená imunita. Co se týče imunogenicity mRNA in vivo a účinnosti translace, proces IVT obvykle využívá určité druhy modifikovaných NTP a běžné modifikované nukleotidy jsou pseudouridin (Ψ), N1-methyl-pseudouridin (N1Ψ) a 5-methylcytosin (5mC).
In vitro transkripční proces mRNA
Schéma reakce in vitro transkripce (IVT).
Podrobnosti o službách
Volitelná služba |
Podrobnosti služby |
Dodací lhůta (pracovní den) |
In vitro transkripce (IVT) |
IVT, in vitro transkripce |
1 |
| Nukleotidové modifikace (Ψ/N1Ψ/5mC atd.) |
| Odstranění templátu DNA (DNáza I) |
Optimalizace podmínek IVT - volitelná |
Návrh a optimalizace komponent reakce IVT |
2-5 |
Naše funkce
- Diverzifikované strategie modifikace nukleotidů
Zlepšení stability mRNA a proteinové exprese in vivo.
- Návrh a optimalizace přísných testů
Lze dosáhnout přípravy fragmentu mRNA až do 10 kb.
Optimalizací reakčních podmínek IVT je rychlost transkripce až 1:200.
Přísná kontrola RNázy prostřednictvím experimentálního prostředí a spotřebního materiálu může účinně zabránit degradaci mRNA.
Případová studie
Současný reakční systém IVT je zhruba optimalizován pro syntetické systémy o délce asi 100 nt, nikoli pro mRNA libovolné délky. Čím delší je sekvence mRNA, tím je obtížnější ji přepisovat a tím je náchylnější k degradaci.
Aby bylo možné připravit přizpůsobené sekvence mRNA o délce asi 10 kb, Yaohai Bio-Pharma úspěšně připravila vysoce kvalitní vzorky s vysokým transkripčním poměrem 1:135 a získala 135 μg původně purifikovaných produktů mRNA po 1 μg linearizovaného plazmidu byl transkribován in vitro přes přísný experimentální design, kontinuální optimalizaci reakčních podmínek a přísnou kontrolu RNázy.
mRNA Identify (agarózová gelová elektroforéza)
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
