Pokud jde o dávkovou přípravu prekurzorů RNA, běžně používanou metodou je in vitro transkripce (IVT). Reakce IVT používá linearizovanou plazmidovou DNA obsahující T7 promotor jako šablonu a syntetizuje prekurzor RNA s nukleosid-trifosfáty (NTP) jako substrát v přítomnosti T7 RNA polymerázy.
Metody cyklikace in vitro zahrnují chemickou ligaci, enzymatickou ligaci a metodu permutovaného intron-exon (PIE). Chemická ligace a enzymatická ligace jsou vhodné pro cyklikaci kratších RNA. Pokud je fragment delší než 100 nt, rychlost cyklikace se výrazně sníží. Naopak metoda nukleáz založená na systému PIE může dosáhnout cyklikace sekvencí délky 8 kb.
Pod katalýzou guanosin-trifosfátu (GTP) dochází u struktury PIE ke cyklikaci extra-intronových sekvencí. Spojením s rozumnou strategií zvyšující rychlost cyklikace může Yaohai Bio-Pharma dosáhnout cyklikace sekvencí délkou až 4 kb s efektivitou více než 80 %.
Reakce cyklikace RNA in vitro probíhá následovně:
Předchůdce RNA je syntetizován in vitro transkripcí a komponenta PIE dokončí samo-splicing pod katalýzou GTP, aby vytvořila circRNA.
Detaily služeb
| Proces |
Detaily služby |
Doba dodání (pracovní den) |
| Transkripcese in vitro a cirkulace |
Potvrzení reakčního systému |
1-2 |
| Reakce transkripcese in vitro a cyklizace |
| Destruckce RNase R |
| Optimalizace reakce |
Skladba reakce, optimalizace času |
2-5 |
Naše funkce
- Přísné navrhování a optimalizace testů
Lze dosáhnout cyklikace RNA až do délky 4 kb.
- Vysoká účinnost cyklikace
Dosažitelnost míry cyklikace přes 80 % pomocí racionální strategie optimalizace sekvence.
Přes prostřednictví přísné kontroly RNasů v experimentálním prostředí a spotřebičích je účinně zabráněno degradaci RNA.
Případová studie
In vitro cyklikace a obohacování circRNA
Na základě systému PIE firma Yaohai Bio-Pharma optimalizovala sekvenci circRNA, s mírou cyklikace více než 80% podle elektroforeze v agárovém gelem (AGE). Pomocí RNase R se obohacuje circRNA, výsledky elektroforeze E-gel ukazují, že lineární RNA předchůdce je vyžehlen, a po dalším čištění lze odebrat většinu poškozené circRNA. Čištěcí roztok byl vyvinut vlastními silami Yaohai Bio-Pharma.
In vitro cyklikace a obohacování circRNA
CS
EN
AR
HR
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
