Kruhové RNA (circRNA) byly poprvé objeveny jako nenávazné RNA v roce 1979; až v roce 2015 byly detekovány transkribované circRNA u drozofil, což vedlo ke studiu in vitro circRNA pro léčebné a preventivní účely.
circRNA jsou samorozšiřující se a proto nemají konvenční strukturu, jako je 5' kloba nebo 3' polyA ocas. Tato struktura je důvodem jejich vyšší stability a odolnosti vůči exonukleázám, jako je RNase R.
Strukturální prvky kruhové RNA (circRNA)
DNA šablona pro syntézu circRNA obvykle zahrnuje interní lokalizační signál ribosomu (IRES), otevřený čtecí rámec (ORF) a další prvky, které jsou kritické pro in vitro cirkulaci. Například jsme navrhli plazmid jako šablonu pro in vitro transkripci (IVT), která se skládá z homologních ramen, 3’ intronu, 3’ exonu, IRES, ORF, 5’ exonu a 5’ intronu, aby se připravily circRNA metodami samo-splicingu.
Interní místo vstupu ribosomy (IRES) vykonává důležité role při překládání cirRNA. IRES z encefalomyokarditidního viru (EMCV), IRES z enteroviru B3 (CVB3), IRES z lidského rynoviru B3 (HRV-B3) a další IRES byly běžně využívány pro překlad vitro syntézy cirRNA.
In vivo cyklikace lineárních prekurzorů circRNA poskytuje důležitý krok v syntéze circRNA, obvykle prostřednictvím chemických, enzymatických a ribozomálně médiovaných samořeplikacích cest. Jako milník v oboru je znám chemický přístup k produkci circRNA, který vznikl v roce 1988, dnes již není používán kvůli své vysoké nákladnosti, nízkému výnosu, velkému množství vedlejších produktů a skutečnosti, že je použitelný pouze pro cyklikaci RNA s délkou až 70 nucleotidů.
Enzymatické metody na cyklování RNA jsou založeny na enzymech bakteriofágu T4 nebo ribozymech, jako jsou T4 DNA ligáza (T4 Dnl 1), T4 RNA ligáza 1 (T4 Rnl 1) a T4 RNA ligáza 2 (T4 Rnl 2). K vytvoření kruhové RNA pomocí enzymů bakteriofágu T4 musí být nukleosidní monofosfát umístěn na 5' konci a spojen s OH skupinou na 3' konci RNA. Protože během reakce se přidávají nukleosidní trifosfáty, IVT RNA obsahuje guanosinový trifosfát (GTP) na 5’ konci.
Ribozymy jsou RNA sekvence, které podporují samo-splicování převodem lineárních RNA molekul na circRNA bez potřeby dalších enzymů. Proces samo-sbírání zahrnuje dvě po sobě jdoucí transesterifikační reakce na specifických místech, aby bylo zajištěno vytvoření požadovaných produktů cirRNA. Metoda samo-splicování skupiny I intronů, také známá jako PIE (inkapsulace intronu a exonu), která umožňuje produkci circRNA déle než 5 kb, byla rozsáhle studována a ukázala se jako užitečná.
Aplikace kruhového RNA (circRNA)
CircRNA vakcíny
Stejně jako lineární mRNA mohou být circRNA převedeny do určitých bílkovin v cílových buňkách a vyvolat silnou humorní a buněčnou imunitu. Nedávno několik výzkumných týmů úspěšně vyvinulo circRNA vakcíny pro prevenci COVID-19. Jejich výsledky nejen, že mají výhody lineárních mRNA vakcín, ale také se pyšní lepší stabilitou a delším časem expresce bílků než lineární mRNA. Proto mohou circRNA vakcíny vyvolat dostatečné imunologické reakce i při nízkých dávkách.
Navíc někteří výzkumníci tvrdí, že circRNA vakcíny, jako další generace mRNA, mohou v budoucnosti stát se efektivními nástroji pro boj proti běžným virálním/bakteriálním chorobám a hlavním novým infekčním onemocněním, stejně jako pro léčbu rakoviny a dalších nemocí.
CircRNA v terapii CAR/TCR-T
Jako pionýr v oblasti kruhového RNA ORNA vyvíjí terapii in situ chimerickým antigenovým receptorem (CAR) pro lokální léčbu, která využívá ORN-101, LNP-kapsle obsahující kruhovou RNA, na modulaci imunitních buněk u pacientů. ORN-101 prezentuje vysoké vyjádření CAR řízené optimalizovaným IRES elementem. V zvířecích modelech bylo ukázáno, že ORN-101 způsobuje potlačení a ničení nádorů, což naznačuje, že ORN-101-bazované protinádorové terapie mohou interferovat s konvenčními CAR-T buněčnými terapiemi.
Navíc Zhang et al. zhodnotili životaschopnost a léčebnou účinnost circRNA v antigen-spécifických T-buněčných receptorových (TCR)-T terapiích. Navrhli circRNA kodující pp65-TCR-T namířené na epitop pp65 cytomegaloviru (CMV). Kromě toho bylo dokázáno, že pp65-TCR je vyjadřován na primárních T buňkách po více než 7 dnech. Kromě toho circRNA-pp65-TCR-T buňky specificky a konzistentně likvidovaly tumorové buňky vyjadřující pp65 a HLA a významně prodloužily přežití myši.
Bylo také ukázáno, že buňky transfekované s pp65 circRNA vykazují lepší imunitní odpověď ve srovnání s lineární mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma Kompletní CRDMO Řešení pro Long-Coding RNA
|
Katalogové RNA produkty
- Katalogové mRNA produkty
- Katalogové saRNA produkty
- Katalog circRNA produktů
|
Vlastní syntéza RNA
- Vlastní syntéza mRNA
- Vlastní syntéza saRNA
- Vlastní syntéza circRNA
|
služby CDMO mRNA
- Vývoj procesu
- Výroba podle GMP
- Asceptické vyplňování a dokončování
- Analýza a testování
|
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
