Síntese in vitro de mRNA
Os principais componentes do mRNA são 5'-cap, 5'-UTR, quadro de leitura aberto (ORF), 5'-UTR e cauda 5' poli A, que são essenciais para manter a função do mRNA. Os pesquisadores usaram uma variedade de métodos para identificar e otimizar sequências e estruturas de mRNA.
A síntese de mRNA é realizada com base na transcrição in vitro (IVT) usando modelos lineares de DNA, RNA polimerases (T3, T7 ou SP6), nucleotídeos não modificados ou modificados, enzimas e reagentes apropriados.
Modificação da tampa de 5'
As sequências de mRNA maduro de eucariotos mostram uma capa de 7-metilguanosina (m7G) na extremidade 5', o que melhora a estabilidade do mRNA e a eficiência da tradução. Existem dois métodos gerais para capturar mRNA in vitro. Primeiro, o mRNA pode ser limitado junto com a transcrição in vitro adicionando um análogo da estrutura m7GpppG (por exemplo, CleanCap) ao sistema IVT. Este método de capeamento co-transcricional fornece uma estrutura natural de cápsula 5' e aumenta a eficiência do capeamento para quase 90-99%. Em segundo lugar, o mapeamento de ARNm também pode ser realizado através do mapeamento de reacções enzimáticas após a reacção de transcrição in vitro.
Modificação PolyA
A cauda poli(A) também prolonga a meia-vida do mRNA in vivo e melhora a eficiência da tradução do mRNA. O comprimento da cauda poli(A) amplificada deve ser de 100-300 nucleotídeos. Além disso, a adenosina modificada aumenta a estabilidade da cauda poli A contra a degradação da RNase celular. A cauda poli A pode ser inserida por transcrição in vitro usando o molde de DNA que codifica poli A, resultando assim em um comprimento de sequência poli A específico. A polimerase poli A recombinante também pode ser usada por poliadenilação enzimática após transcrição de mRNA.
Modificação de Nucleotídeos
Os nucleosídeos modificados podem inibir o reconhecimento e/ou ativação dos receptores de reconhecimento de padrões (PRR) e aumentar a eficácia das vacinas de mRNA de duas maneiras totalmente diferentes. A adição de certos nucleosídeos quimicamente modificados, incluindo pseudouridina (ψ), 1-metilpseudouridina (m1ψ), tiouridina (s4U) e 5-metilcitosina (m5C) pode prevenir a ativação de TLR7/8 e outros receptores imunes inatos, que reduzem significativamente a imunogenicidade de mRNA.
Sistema de entrega de mRNA
Para manter a função do mRNA, ele precisa entrar no citoplasma do hospedeiro e expressar antígenos específicos. Um dos desafios mais difíceis enfrentados pelas vacinas e terapêuticas de mRNA reside na entrega de mRNA em células alvo com níveis de tradução suficientemente elevados, pois requer sistemas de entrega de mRNA altamente específicos e eficientes. Vários vetores de entrega de mRNA foram desenvolvidos e utilizados, incluindo células dendríticas (DCs), protamina, polímeros catiônicos e lipossomas catiônicos.
Complexos de lipídios catiônicos com mRNA e outras preparações podem formar coletivamente nanopartículas de tamanho de 80-200 nm denominadas nanopartículas lipídicas (LNPs). Como um dos sistemas de entrega de mRNA mais avançados, o LNP inclui lipídios catiônicos ionizáveis, fosfolipídios naturais, colesterol e polietilenoglicol (PEG). Várias vacinas e terapias de RNA (siRNA e mRNA) aprovadas pela Food and Drug Administration dos EUA são baseadas em sistemas de entrega de LNP.
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Entregáveis personalizados
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Grade
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Entregas
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Especificação
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Aplicações
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não GMP
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Substância medicamentosa, mRNA
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0.1~10 mg (mRNA)
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Pesquisa pré-clínica, como transfecção celular, desenvolvimento de métodos analíticos, estudos de pré-estabilidade, desenvolvimento de formulações
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Medicamento, LNP-mRNA
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BPF, Esterilidade
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Substância medicamentosa, mRNA
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10mg~70g
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Novo medicamento experimental (IND), Autorização de ensaio clínico (CTA), Fornecimento de ensaio clínico, Pedido de licença biológica (BLA), Fornecimento comercial
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Medicamento, LNP-mRNA
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5000 frascos ou seringas/cartuchos pré-cheios
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