Síntese in Vitro de mRNA
Os principais componentes do mRNA são o 5’-cap, 5’-UTR, quadro de leitura aberto (ORF), 5’-UTR e cauda poli A 5’, que são essenciais para manter a função do mRNA. Pesquisadores utilizaram uma variedade de métodos para identificar e otimizar sequências e estruturas de mRNA.
A síntese de mRNA é realizada com base no transcritor in vitro (IVT) utilizando templates lineares de DNA, polimerases RNA (T3, T7 ou SP6), nucleotídeos não modificados ou modificados, enzimas e reagentes apropriados.
Modificação do Cap 5'
As sequências de mRNA maduro de eucariotos mostram um cap de 7-metilguanosina (m7G) na extremidade 5', o que melhora a estabilidade do mRNA e a eficiência translacional. Existem dois métodos gerais para capturar mRNA in vitro. Primeiro, o mRNA pode ser chapado junto com o transcritor in vitro adicionando um analógico de cap da estrutura m7GpppG (por exemplo, CleanCap) ao sistema IVT. Este método de chapamento co-transcricional fornece uma estrutura natural de cápsula 5' e aumenta a eficiência de chapamento para quase 90-99%. Em segundo lugar, o mapeamento do mRNA também pode ser realizado por reações enzimáticas de mapeamento após a reação de transcrição in vitro.
Modificação PolyA
A cauda poli(A) também prolonga a meia-vida do mRNA in vivo e melhora a eficiência de tradução do mRNA. O comprimento da cauda poli(A) amplificada deve ser de 100-300 nucleotídeos. Além disso, a adenosina modificada aumenta a estabilidade da cauda poli A contra a degradação por RNase celular. A cauda poli A pode ser inserida por transcrição in vitro usando um template de DNA codificando poli A, resultando assim em um comprimento específico da sequência poli A. A polimerase poli A recombinante também pode ser usada pela poliadilação enzimática após a transcrição do mRNA.
Modificação de Nucleotídeos
Nucleosídeos modificados podem inibir o reconhecimento e/ou ativação por receptores de reconhecimento de padrões (PRR) e melhorar a eficácia das vacinas de mRNA de duas maneiras totalmente diferentes. A adição de certos nucleosídeos quimicamente modificados, incluindo pseudouridina (ψ), 1-metilpseudouridina (m1ψ), tiouridina (s4U) e 5-metilcitosina (m5C), pode prevenir a ativação de TLR7/8 e outros receptores imunológicos inatos, o que reduz significativamente a imunogenicidade do mRNA.
Sistema de Entrega de mRNA
Para manter a função do mRNA, ele precisa entrar no citoplasma do hospedeiro e expressar antígenos específicos. Um dos desafios mais difíceis enfrentados pelas vacinas e terapias de mRNA está em entregar o mRNA em células-alvo com níveis de tradução suficientemente altos, o que exige sistemas de entrega de mRNA altamente específicos e eficientes. Vários vetores de entrega de mRNA foram desenvolvidos e utilizados, incluindo células dendríticas (DCs), protamina, polímeros catiônicos e lipossomas catiônicos.
Complexos de lipídeos catiônicos com mRNA e outras preparações podem formar coletivamente nanopartículas de 80-200 nm chamadas nanopartículas lipídicas (LNPs). Como um dos sistemas de entrega de mRNA mais avançados, LNP inclui lipídeos catiônicos ionizáveis, fosfolipídeos naturais, colesterol e polietileno glicol (PEG). Vários vacinas RNA e terapias (siRNA e mRNA) aprovadas pela Food and Drug Administration dos EUA são baseadas em sistemas de entrega LNP.
Yaohai Bio-Pharma Oferece Solução Completa para RNA
Entregáveis Personalizados
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Grau
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Entregáveis
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Especificações
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Aplicações
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não-GMP
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Substância Medicamentosa, mRNA
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0,1~10 mg (mRNA)
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Pesquisa pré-clínica, como transfeção celular, Desenvolvimento de métodos analíticos, Estudos pré-estabilidade, Desenvolvimento de formulação
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Produto Farmacêutico, LNP-mRNA
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GMP, Estéril
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Substância Medicamentosa, mRNA
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10 mg~70 g
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Investigational new drug (IND), Autorização de ensaio clínico (CTA), Suprimento para ensaios clínicos, Biologic license application (BLA), Suprimento comercial
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Produto Farmacêutico, LNP-mRNA
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5000 frascos ou seringas pré-enchidas / cartuchos
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