Os RNAs circulares (circRNAs) foram descobertos pela primeira vez como RNAs não codificantes em 1979; somente em 2015 foram encontrados circRNAs transcritos em Drosophila, o que levou ao estudo de circRNAs in vitro para fins terapêuticos e preventivos.
Os circRNAs são autoexpansíveis e, portanto, não possuem uma estrutura convencional, como um cap 5' ou uma cauda poliA 3'. Esta estrutura os torna mais estáveis e resistentes a exonucleases como a RNase R.
Elementos estruturais do RNA circular (circRNA)
O DNA modelo para a síntese de circRNA normalmente inclui o local interno de entrada do ribossomo (IRES), o quadro de leitura aberto (ORF) e outros que são críticos para a circulação in vitro. Por exemplo, projetamos um plasmídeo como modelo de transcrição in vitro (IVT), que consiste em braços de homologia, íntron 3', éxon 3', IRES, ORF, éxon 5' e íntron 5', para preparar circRNA por auto-splicing métodos.
O local interno de entrada do ribossomo (IRES) desempenha papéis importantes na tradução de cirRNAs. Vírus da encefalomiocardite (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, rinovírus humano B3 (HRV-B3) IRES e outros IRES têm sido comumente utilizados para a tradução da síntese vitro de cirRNAs
A ciclização in vivo de precursores lineares de circRNA fornece um passo importante na síntese de circRNA, geralmente através de vias de auto-replicação químicas, enzimáticas e mediadas por ribossomos. Conhecida como um marco na área, a abordagem química para produção de circRNA, originada em 1988, não é mais utilizada atualmente devido ao seu alto custo, baixo rendimento, elevado número de subprodutos e ao fato de ser adequada apenas para ciclização. RNAs com até 70 nucleotídeos de comprimento.
Os métodos enzimáticos para ciclizar RNA são baseados em enzimas ou ribozimas do bacteriófago T4, como T4 DNA ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1) e T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2). Para formar RNA circular pelas enzimas do bacteriófago T4, os nucleosídeos monofosfatos devem estar localizados na extremidade 5' e conjugados ao grupo OH na extremidade 3' do RNA. Como os trifosfatos de nucleosídeo são adicionados durante a reação, o RNA IVT contém trifosfato de guanosina (GTP) na extremidade 5'.
Ribozimas são sequências de RNA que promovem o auto-splicing convertendo moléculas lineares de RNA em circRNA sem a necessidade de enzimas adicionais. O processo de automontagem envolve duas reações consecutivas de transesterificação em locais específicos para garantir que os produtos de cirRNA desejados sejam formados. O método de auto-splicing de íntrons do grupo I, também conhecido como PIE (encapsulamento de íntrons e exons), que permite a produção de cirRNAs maiores que 5 kb, tem sido extensivamente estudado e tem se mostrado útil.
Aplicação de RNA Circular (circRNA)
Vacinas CircRNA
Assim como os mRNAs lineares, os circRNAs podem ser convertidos em certas proteínas nas células-alvo e induzir a robusta imunidade humoral e celular. Recentemente, existem algumas equipes de pesquisa que desenvolveram com sucesso vacinas de circRNA para prevenir a COVID-19. Os seus resultados não só possuíram os benefícios das vacinas de mRNA linear, mas também apresentaram uma melhor estabilidade e maior duração da expressão proteica do que o mRNA linear. Portanto, as vacinas circRNA podem induzir respostas imunológicas adequadas mesmo em doses baixas.
Além disso, alguns investigadores pensam que as vacinas circRNA, como mRNAs da próxima geração, podem tornar-se ferramentas eficazes no futuro para combater doenças virais/bacterianas comuns e as principais doenças infecciosas emergentes, bem como para o tratamento do cancro e outras doenças.
CircRNA na terapia CAR/TCR-T
Como pioneira no campo do RNA circular, a ORNA vem desenvolvendo terapia de receptor de antígeno quimérico (CAR) in situ para terapia in situ que utiliza ORN-101, um RNA circular encapsulado em LNP, para modular células imunológicas em pacientes. ORN-101 apresenta alta expressão do CAR impulsionado por um elemento IRES otimizado. Em modelos animais, foi demonstrado que o ORN-101 induz a supressão e destruição tumoral, sugerindo que as terapias anticâncer baseadas em ORN-101 podem interferir na terapia convencional com células CAR-T.
Além disso, Zhang et al. avaliaram a viabilidade e eficácia terapêutica de circRNAs em terapias com receptor de células T específico para antígeno (TCR)-T. Eles projetaram um circRNA que codifica pp65-TCR-T visando o epítopo pp65 do citomegalovírus (CMV). Além disso, demonstrou-se que o pp65-TCR é expresso em células T primárias durante mais de 7 dias. Além disso, as células circRNA-pp65-TCR-T mataram específica e consistentemente células tumorais que expressam pp65 e HLA e prolongaram significativamente o tempo de sobrevivência dos camundongos.
Foi também demonstrado que as células transfectadas com circRNA pp65 exibiram melhores respostas imunitárias em comparação com o ARNm linear.
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