RNAs circulares (circRNAs) foram inicialmente descobertos como RNAs não codificantes em 1979; não foi até 2015 que circRNAs transcritas foram encontradas em Drosophila, o que levou ao estudo de circRNAs in vitro para fins terapêuticos e preventivos.
circRNAs são auto-expansíveis e, portanto, não possuem uma estrutura convencional, como um cap 5' ou uma cauda polyA 3'. Essa estrutura os torna mais estáveis e resistentes a exornucleases como a RNase R.
Elementos Estruturais do RNA Circular (circRNA)
O DNA modelo para síntese de circRNA geralmente inclui sítio de entrada ribossômica interna (IRES), quadro de leitura aberto (ORF) e outros que são críticos para a circulação in vitro. Por exemplo, projetamos um plasmídeo como modelo de transcrição in vitro (IVT), que consiste em braços de homologia, intron 3', exon 3', IRES, ORF, exon 5' e intron 5', para preparar circRNA por métodos de autosplicagem.
O Sítio de Entrada Interna do Ribossomo (IRES) desempenha papéis importantes na tradução de cirRNAs. O IRES do vírus da encefalomiotocardite (EMCV), o IRES do coxsackievírus B3 (CVB3), o IRES do rinovírus humano B3 (HRV-B3) e outros IRES foram comumente utilizados para a tradução da síntese in vitro de cirRNAs.
A ciclização in vivo dos precursores lineares de circRNA fornece uma etapa importante na síntese de circRNA, geralmente por meio de vias químicas, enzimáticas e de autoreplicação mediada por ribossomos. Conhecida como um marco no campo, a abordagem química para a produção de circRNA, originada em 1988, não é mais usada hoje devido ao seu alto custo, baixo rendimento, grande número de subprodutos e ao fato de ser apenas adequada para ciclizar RNAs de até 70 nucleotídeos de comprimento.
Os métodos enzimáticos para ciclização de RNA são baseados em enzimas do bacteriófago T4 ou ribozimas, como a ligase de DNA T4 (T4 Dnl 1), a ligase de RNA T4 1 (T4 Rnl 1) e a ligase de RNA T4 2 (T4 Rnl 2). Para formar RNA circular usando enzimas do bacteriófago T4, monofosfatos de nucleosídeos devem estar localizados na extremidade 5' e conjugados ao grupo OH na extremidade 3' do RNA. Como trifosfatos de nucleosídeos são adicionados durante a reação, o RNA IVT contém guanosina trifosfato (GTP) na extremidade 5’.
Ribozimas são sequências de RNA que promovem a autosplicagem, convertendo moléculas lineares de RNA em circRNA sem a necessidade de enzimas adicionais. O processo de auto-montagem envolve duas reações consecutivas de transesterificação em locais específicos para garantir que os produtos cirRNA desejados sejam formados. O método de autosplicagem do intrão do grupo I, também conhecido como PIE (encapsulamento de introns e exons), que permite a produção de cirRNAs maiores que 5 kb, foi amplamente estudado e provou ser útil.
Aplicação de RNA Circular (circRNA)
Vacinas circRNA
Assim como os mRNAs lineares, os circRNAs podem ser convertidos em certas proteínas nas células-alvo e induzir uma robusta imunidade humoral e celular. Recentemente, algumas equipes de pesquisa desenvolveram com sucesso vacinas circRNA para prevenir a COVID-19. Seus resultados não apenas possuem os benefícios das vacinas de mRNA linear, mas também se destacam por uma melhor estabilidade e uma duração mais longa da expressão da proteína em comparação com o mRNA linear. Portanto, as vacinas circRNA podem induzir respostas imunes adequadas mesmo em doses baixas.
Além disso, alguns pesquisadores acreditam que as vacinas circRNA, como as próximas gerações de mRNAs, podem se tornar ferramentas eficazes no futuro para combater doenças virais/bacterianas comuns e principais doenças infecciosas emergentes, além do tratamento do câncer e outras doenças.
CircRNA na Terapia CAR/TCR-T
Como pioneira no campo do RNA circular, a ORNA tem desenvolvido terapia de receptor de antígeno quimérico (CAR) in situ para terapia in situ que utiliza o ORN-101, um RNA circular encapsulado em LNP, para modular células imunes nos pacientes. O ORN-101 apresenta uma alta expressão do CAR impulsionada por um elemento IRES otimizado. Em modelos animais, foi demonstrado que o ORN-101 induz supressão e destruição de tumores, sugerindo que terapias anticâncer baseadas em ORN-101 podem interferir com a terapia convencional de CAR-T.
Além disso, Zhang et al. avaliaram a viabilidade e a eficácia terapêutica de circRNAs em terapias de receptor de células T (TCR)-T específicas de antígenos. Eles projetaram um circRNA codificando pp65-TCR-T direcionado ao epitopo pp65 do citomegalovírus (CMV). Além disso, foi demonstrado que o pp65-TCR é expresso em células T primárias por mais de 7 dias. Além disso, as células circRNA-pp65-TCR-T especificamente e consistentemente mataram células tumorais que expressam pp65 e HLA e significativamente prolongaram o tempo de sobrevivência dos camundongos.
Também foi mostrado que células transfetadas com pp65 circRNA exibiram melhores respostas imunológicas em comparação com mRNA linear.
Solução Integral de CRDMO da Yaohai para RNA de Longa Codificação
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
