원형 RNA(circRNA)

양식적임

원형 RNA(circRNA)는 1979년에 비암호화 RNA로 처음 발견되었습니다. 초파리에서 전사된 circRNA가 발견된 것은 2015년이 되어서야 치료 및 예방 목적을 위한 시험관 내 circRNA 연구로 이어졌습니다.

circRNA는 자체 확장되므로 5' 캡 또는 3' 폴리A 꼬리와 같은 기존 구조를 갖지 않습니다. 이 구조는 RNase R과 같은 엑소뉴클레아제에 대해 더욱 안정적이고 저항성을 갖게 합니다.

원형 RNA(circRNA)의 구조 요소

circRNA 합성을 위한 주형 DNA에는 일반적으로 IRES(내부 리보솜 진입 부위), ORF(오픈 리딩 프레임) 및 시험관 내 순환에 중요한 기타 요소가 포함됩니다. 예를 들어, 자가 접합을 통해 circRNA를 준비하기 위해 상동성 암, 3' 인트론, 3' 엑손, IRES, ORF, 5' 엑손 및 5' 인트론으로 구성된 시험관 내 전사체(IVT) 템플릿으로 플라스미드를 설계했습니다. 행동 양식.

내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 cirRNA 번역에서 중요한 역할을 수행합니다. 뇌심근염 바이러스(EMCV) IRES, 콕사키바이러스 B3(CVB3) IRES, 인간 라이노바이러스 B3(HRV-B3) IRES 및 기타 IRES는 일반적으로 cirRNA의 시험관 합성 번역에 활용되어 왔습니다.

circRNA 선형 전구체의 생체 내 고리화는 일반적으로 화학적, 효소적 및 리보솜 매개 자가 복제 경로를 통해 circRNA 합성에서 중요한 단계를 제공합니다. 현장에서 이정표로 알려진 circRNA 생산을 위한 화학적 접근 방식은 1988년에 시작되었지만 높은 비용, 낮은 수율, 높은 부산물 수 및 순환에만 적합하다는 사실로 인해 오늘날 더 이상 사용되지 않습니다. 최대 70개 뉴클레오티드 길이의 RNA입니다.

RNA 고리화를 위한 효소적 방법은 T4 DNA 리가제(T4 Dnl 4), T1 RNA 리가제 4(T1 Rnl 4) 및 T1 RNA 리가제 4(T2 Rnl 4)와 같은 박테리오파지 T2 효소 또는 리보자임을 기반으로 합니다. T4 박테리오파지 효소에 의해 원형 RNA를 형성하려면 뉴클레오시드 모노포스페이트가 5' 말단에 위치해야 하며 RNA의 3' 말단에 있는 OH 그룹에 접합되어야 합니다. 반응 중에 뉴클레오시드 삼인산이 첨가되기 때문에 IVT RNA는 5' 말단에 구아노신 삼인산(GTP)을 포함합니다.

리보자임은 추가 효소 없이 선형 RNA 분자를 circRNA로 전환하여 자가접합을 촉진하는 RNA 서열입니다. 자가 조립 과정에는 원하는 cirRNA 생성물이 형성되는지 확인하기 위해 특정 부위에서 두 번의 연속적인 에스테르교환 반응이 포함됩니다. 5kb보다 긴 cirRNA를 생성할 수 있는 PIE(인트론 및 엑손 캡슐화)라고도 알려진 그룹 I 인트론 자가 접합 방법은 광범위하게 연구되어 유용한 것으로 입증되었습니다.

원형 RNA(circRNA)의 응용

CircRNA 백신

선형 mRNA와 마찬가지로 circRNA는 표적 세포에서 특정 단백질로 전환될 수 있으며 강력한 체액성 및 세포성 면역을 유도할 수 있습니다. 최근 코로나19 예방을 위한 circRNA 백신 개발에 성공한 일부 연구팀이 있다. 그 결과는 선형 mRNA 백신의 이점을 가질 뿐만 아니라 선형 mRNA보다 더 나은 안정성과 더 긴 단백질 발현 기간을 자랑했습니다. 따라서 circRNA 백신은 낮은 용량으로도 적절한 면역반응을 유도할 수 있습니다.

또한 일부 연구자들은 차세대 mRNA인 circRNA 백신이 미래에 일반적인 바이러스/세균성 질병과 주요 신흥 전염병 퇴치뿐만 아니라 암 및 기타 질병 치료를 위한 효과적인 도구가 될 수 있다고 생각합니다.

CAR/TCR-T 치료의 CircRNA

원형 RNA 분야의 선구자로서 ORN은 환자의 면역 세포를 조절하기 위해 LNP로 캡슐화된 원형 RNA인 ORN-101을 활용하는 현장 치료를 위한 현장 키메라 항원 수용체(CAR) 치료법을 개발해 왔습니다. ORN-101은 최적화된 IRES 요소에 의해 구동되는 CAR의 높은 발현을 나타냅니다. 동물 모델에서 ORN-101은 종양 억제 및 파괴를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 ORN-101 기반 항암 치료법이 기존 CAR-T 세포 치료법을 방해할 수 있음을 시사합니다.

또한, Zhang et al. 항원 특이적 T세포 수용체(TCR)-T 치료법에서 circRNA의 생존 가능성과 치료 효능을 평가했습니다. 그들은 거대세포바이러스(CMV)의 pp65 에피토프를 표적으로 하는 pp65-TCR-T를 인코딩하는 circRNA를 설계했습니다. 또한, pp65-TCR은 7일 이상 일차 T 세포에서 발현되는 것으로 입증되었습니다. 또한, circRNA-pp65-TCR-T 세포는 pp65 및 HLA 발현 종양 세포를 특이적이고 지속적으로 사멸시키고 생쥐의 생존 시간을 크게 연장시켰습니다.

또한 pp65 circRNA로 형질감염된 세포는 선형 mRNA에 비해 더 나은 면역 반응을 나타내는 것으로 나타났습니다.

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