원형 RNA (circRNA)

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순환 RNA(circRNA)는 1979년 비번역 RNA로 처음 발견되었으며, 2015년에야 과일蠅에서 전사된 circRNA가 발견되면서 치료 및 예방 목적으로 체외 circRNA 연구가 시작되었습니다.

circRNA는 자가 확장이 가능하기 때문에 일반적인 5' 캡 구조나 3' polyA 꼬리가 없습니다. 이러한 구조는 그들을 더 안정적으로 만들고 RNase R과 같은 엑소핵산분해효소에 대해 저항성을 가지게 합니다.

순환 RNA (circRNA)의 구조 요소

CircRNA 합성에 사용되는 템플릿 DNA에는 일반적으로 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 개방 판독 프레임(ORF) 등 체외 순환에 중요한 요소들이 포함됩니다. 예를 들어, 우리는 동형 팔, 3’ 인트론, 3’ 엑손, IRES, ORF, 5’ 엑손, 그리고 5’ 인트론으로 구성된 플라스미드를 설계하여 자기 스플라이싱 방법을 통해 circRNA를 준비하는 데 사용했습니다.

내부 리보좀 진입 부위 (IRES)는 cirRNA의 번역에서 중요한 역할을 수행합니다. 엔cephalomyocarditis 바이러스 (EMCV) IRES, 콕사키바이러스 B3 (CVB3) IRES, 인간 라이노바이러스 B3 (HRV-B3) IRES 및 기타 IRES는 일반적으로 cirRNA의 체외 합성 번역에 사용되어 왔습니다.

CircRNA 선형 전구체의 체내 순환화는 일반적으로 화학적, 효소적 및 리보좀 매개 자기 복제 경로를 통해 circRNA 합성에서 중요한 단계를 제공합니다. 1988년에 시작된 circRNA 생산을 위한 화학적 접근 방식은 비용이 많이 들고 수율이 낮으며 부산물이 많으며 70개의 뉴클레오타이드 길이까지 순환화에 적합하기 때문에 오늘날 더 이상 사용되지 않습니다.

RNA 순환을 위한 효소적 방법은 T4 DNA 리가제 (T4 Dnl 1), T4 RNA 리가제 1 (T4 Rnl 1), 그리고 T4 RNA 리가제 2 (T4 Rnl 2)와 같은 박테리오파지 T4 효소나 리보자임에 기반합니다. T4 박테리오파지 효소로 순환형 RNA를 형성하려면, 뉴클레오사이드 모노인산이 RNA의 5' 말단에 위치하고 3' 말단의 OH 기와 결합되어야 합니다. 반응 중 뉴클레오사이드 트리인산이 추가되기 때문에 IVT RNA는 5' 말단에서 구아노신 트리인산(GTP)을 포함하게 됩니다.

리보자임은 추가적인 효소가 필요 없이 선형 RNA 분자를 circRNA로 변환할 수 있도록 자가 스플라이싱을 촉진하는 RNA 서열입니다. 자가 조립 과정은 원하는 cirRNA 제품이 형성되도록 특정 위치에서 두 번의 연속적인 트랜스에스터화 반응을 포함합니다. 5 kb 이상의 길이의 cirRNAs를 생성할 수 있는 그룹 I 인트론 자가 스플라이싱 방법, 또는 PIE(인트론 및 엑손 캡슐화)라고도 알려진 이 방법은 광범위하게 연구되었으며 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.

순환 RNA(circRNA)의 활용

CircRNA 백신

선형 mRNA와 마찬가지로 circRNA는 대상 세포에서 특정 단백질로 변환되어 강력한 체액 면역 및 세포 면역을 유도할 수 있습니다. 최근 몇몇 연구팀은 성공적으로 코로나19 예방을 위한 circRNA 백신을 개발했습니다. 그들의 결과는 선형 mRNA 백신의 장점을 유지하면서도, 더 나은 안정성과 더 긴 단백질 발현 지속 시간을 보여주었습니다. 따라서 circRNA 백신은 저용량에서도 적절한 면역 반응을 유도할 수 있습니다.

또한 일부 연구자들은 circRNA 백신이 차세대 mRNA로서 향후 일반적인 바이러스/박테리아 감염 질환과 주요 신종 전염병을 방어하는 효과적인 도구가 될 수 있을 뿐만 아니라, 암 및 기타 질환 치료에도 사용될 수 있다고 생각합니다.

CAR / TCR-T 요법에서의 CircRNA

원형 RNA 분야의 선구자로서, ORNA는 환자의 면역 세포를 조절하기 위해 LNP로 포장된 원형 RNA인 ORN-101을 이용한 현지 치료용 in situ 카이메라 항원 수용체(CAR) 요법을 개발하고 있습니다. ORN-101은 최적화된 IRES 엘리먼트에 의해 구동되는 CAR의 높은 발현을 특징으로 합니다. 동물 모델에서 ORN-101은 종양 억제 및 파괴를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 ORN-101 기반 항암 요법이 전통적인 CAR-T 세포 요법과 간섭할 가능성을 시사합니다.

또한 장 et al.은 항원 특이적 T 세포 수용체(TCR)-T 요법에서 circRNA의 생존 가능성과 치료 효과를 평가했습니다. 그들은 사이토메갈로바이러스(CMV)의 pp65 에피토프를 대상으로 하는 pp65-TCR-T를 인코딩하는 circRNA를 설계했습니다. 또한 pp65-TCR은 주 T 세포에서 7일 이상 발현될 수 있음을 보여주었습니다. 더불어 circRNA-pp65-TCR-T 세포는 pp65와 HLA를 표현하는 종양 세포를 특정하고 일관되게 제거하며, 쥐들의 생존 시간을 상당히 연장시켰습니다.

또한 pp65 circRNA로 전달된 세포는 선형 mRNA와 비교하여 더 나은 면역 반응을 보였습니다.

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