A cirkuláris RNS-eket (circRNS-eket) először 1979-ben fedezték fel nem kódoló RNS-ként; csak 2015-ben találtak átírt cirRNS-eket Drosophilában, ami az in vitro cirRNS-ek terápiás és megelőző célú vizsgálatához vezetett.
A cirkRNS-ek öntágulóak, ezért nem rendelkeznek hagyományos szerkezettel, például 5'-sapkával vagy 3'-poliA-farokkal. Ez a szerkezet stabilabbá és ellenállóbbá teszi őket az olyan exonukleázokkal szemben, mint az RNáz R.
A cirkuláris RNS (circRNS) szerkezeti elemei
A cirRNS-szintézishez használt templát DNS jellemzően belső riboszóma belépési helyet (IRES), nyitott leolvasási keretet (ORF) és másokat tartalmaz, amelyek kritikusak az in vitro keringés szempontjából. Például egy plazmidot terveztünk in vitro transzkriptum (IVT) templátként, amely homológia karokból, 3' intronból, 3' exonból, IRES-ből, ORF-ből, 5' exonból és 5' intronból áll, hogy önillesztéssel cirRNS-t állítsunk elő. mód.
Az Internal Ribosome Entry Site (IRES) fontos szerepet játszik a cirRNS-ek transzlációjában. Encephalomyocarditis vírus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, humán rhinovirus B3 (HRV-B3) Az IRES és más IRES-eket általánosan alkalmazzák a cirRNS-ek vitro szintézisének transzlációjára.
A cirRNS lineáris prekurzorok in vivo ciklizálása fontos lépést jelent a cirRNS szintézisében, általában kémiai, enzimatikus és riboszóma által közvetített önreplikációs útvonalakon keresztül. A szakterületen mérföldkőként ismert, 1988-ban keletkezett cirrRNS-termelés kémiai megközelítését ma már nem alkalmazzák magas költsége, alacsony hozama, nagyszámú mellékterméke és csak ciklikussága miatt. RNS-ek legfeljebb 70 nukleotid hosszúságúak.
Az RNS ciklizálására szolgáló enzimatikus módszerek T4 bakteriofág enzimeken vagy ribozimeken alapulnak, mint például a T4 DNS-ligáz (T4 Dnl 1), a T4 RNS ligáz 1 (T4 Rnl 1) és a T4 RNS ligáz 2 (T4 Rnl 2). Ahhoz, hogy a T4 bakteriofág enzimek körkörös RNS-t képezzenek, a nukleozid-monofoszfátoknak az RNS 5'-végén kell elhelyezkedniük, és konjugálniuk kell az RNS 3'-végén az OH-csoporthoz. Mivel a reakció során nukleozid-trifoszfátokat adnak hozzá, az IVT RNS guanozin-trifoszfátot (GTP) tartalmaz az 5' végén.
A ribozimok olyan RNS-szekvenciák, amelyek elősegítik az önillesztést azáltal, hogy a lineáris RNS-molekulákat cirkRNS-ré alakítják anélkül, hogy további enzimekre lenne szükség. Az önszerveződési folyamat két egymást követő átészterezési reakciót foglal magában meghatározott helyeken, hogy biztosítsák a kívánt cirRNS-termékek képződését. Az 5 kb-nál hosszabb cirRNS-ek előállítását lehetővé tévő I. csoportba tartozó intron önillesztési módszert, más néven PIE-t (intron and exon encapsulation) alaposan tanulmányozták, és hasznosnak bizonyult.
A cirkuláris RNS (circRNS) alkalmazása
CircRNA vakcinák
A lineáris mRNS-ekhez hasonlóan a cirRNS-ek is átalakulhatnak bizonyos fehérjékké a célsejtekben, és robusztus humorális és celluláris immunitást váltanak ki. A közelmúltban néhány kutatócsoport sikeresen kifejlesztett cirRNS vakcinákat a COVID-19 megelőzésére. Eredményeik nemcsak a lineáris mRNS-vakcinák előnyeivel büszkélkedhettek, hanem jobb stabilitást és hosszabb fehérjeexpressziós időtartamot is mutattak, mint a lineáris mRNS. Ezért a cirrRNS-vakcinák már alacsony dózisokban is megfelelő immunválaszt válthatnak ki.
Ezen túlmenően egyes kutatók úgy vélik, hogy a cirRNS vakcinák, mint új generációs mRNS-ek, a jövőben hatékony eszközökké válhatnak a gyakori vírusos/bakteriális betegségek és a főbb újonnan megjelenő fertőző betegségek elleni küzdelemben, valamint a rák és más betegségek kezelésében.
CircRNA az CAR / TCR-T terápiában
A cirkuláris RNS területén úttörőként az ORNA in situ kiméra antigénreceptor (CAR) terápiát fejlesztett ki in situ terápiához, amely az ORN-101-et, egy LNP-be kapszulázott cirkuláris RNS-t alkalmaz a betegek immunsejtjeinek modulálására. Az ORN-101 az optimalizált IRES elem által vezérelt CAR magas szintű kifejeződését mutatja be. Állatmodellekben kimutatták, hogy az ORN-101 tumorszuppressziót és -pusztulást vált ki, ami arra utal, hogy az ORN-101 alapú rákellenes terápiák megzavarhatják a hagyományos CAR-T sejtterápiát.
Ezenkívül Zhang és mtsai. értékelte a cirrNS-ek életképességét és terápiás hatékonyságát az antigén-specifikus T-sejt receptor (TCR)-T terápiákban. Olyan cirRNS-t terveztek, amely a pp65-TCR-T-t kódolja, amely a citomegalovírus (CMV) pp65 epitópját célozza meg. Ezenkívül kimutatták, hogy a pp65-TCR több mint 7 napig expresszálódik primer T-sejteken. Ezenkívül a circRNS-pp65-TCR-T sejtek specifikusan és következetesen elpusztították a pp65- és HLA-t expresszáló tumorsejteket, és jelentősen meghosszabbították az egerek túlélési idejét.
Azt is kimutatták, hogy a pp65 circRNS-sel transzfektált sejtek jobb immunválaszt mutattak, mint a lineáris mRNS.
A Yaohai Bio-Pharma egyablakos CRDMO megoldása hosszú kódoló RNS-hez
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NEM
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
