A kör RNS-ek (circRNAs) először 1979-ben fedezték fel nem fordított RNS-ként; nem voltak egyértelmű bizonyítékok a transkribált circRNA-ról, amíg 2015-ig nem találtak ilyeneket Drosophilában, ami elvezetett az in vitro circRNA-k terápiás és prevenciós célokra történő tanulmányozásához.
a circRNA-k önfejlesztődőek, ezért nem rendelkeznek olyan konvencionális szerkezettel, mint például a 5' fejszor vagy a 3' polyA farok. Ez a szerkezet stabilebbé teszi őket és részben exonukleázusok ellen, például az RNase R ellen törészkodókat.
A kör RNA (circRNA) szerkezeti elemei
A circRNA szintézishez használt DNA-sablon általában tartalmaz belső riboszombelépési helyet (IRES), nyitott olvasási keretet (ORF) és más elemeket, amelyek kulcsfontosságúak az in vitro cirkulációhoz. Például olyan plazmidot terveztünk, amely sablonként szolgál in vitro transkripcióra (IVT), és amely homológ karokat, 3’ intront, 3’ exont, IRES-et, ORF-t, 5’ exont és 5’ intront tartalmaz, hogy circRNA-kat előállítsunk önsplicing módszerekkel.
Az IRES (Internal Ribosome Entry Site) fontos szerepet játszik a cirRNA-k fordításában. Az EMCV (Encephalomyocarditis vírus), CVB3 (coxsackievirus B3) és HRV-B3 (human rhinovirus B3) IRES, valamint más IRES gyakran használják a cirRNA-k vitro fordításához.
A circRNA lineáris prekursorainak in vivo ciklizálása jelentős lépést képez a circRNA-szintézis során, általában kémiai, enzimatikus és riboszom-meddig útján történő önreplikációval. Ismert milévként a circRNA-gyártás kémiai módja, amely 1988-ban kezdődött, ma már nem használatos, miatt a magas költsége, alacsony szelejteződési aránya, sok oldalszerezete, valamint azért, mivel csak 70 nukleotid hosszúságig alkalmas RNA-k ciklizálására.
Az RNA ciklizálására szolgáló enzimtartalmú módszerek a T4 baktériofág enzimek vagy ribozímok, például a T4 DNA ligáz (T4 Dnl 1), T4 RNA ligáz 1 (T4 Rnl 1) és T4 RNA ligáz 2 (T4 Rnl 2) alapján készülnek. A T4 baktériofág enzimek használatával történő ciklikus RNA létrehozásához nukleozid monofoszfátoknak kell helyezkedniük el a 5' végén, és kötödniük kell az OH csoportot az RNA 3' végénél. Mivel a reakció során hozzáadnak nukleozid triphoszfátokat, az IVT RNA guanin-triphoszfát (GTP) tartalmaz a 5’ végén.
A ribozímok olyan RNA-sorozatok, amelyek önállóan segítik a lineáris RNA molekulák cirkulárisítását további enzimek nélkül. Az önösszerkesztési folyamat két egymás után következő transesterifikációs reakciót tartalmaz specifikus helyeken annak biztosítása érdekében, hogy a kívánt cirRNA termékek képződjenek. A I. csoportú intron önösszerkesztési módszer, más néven PIE (intron és exon befogadás), amely lehetővé teszi a 5 kb-nál hosszabb cirRNA-k előállítását, részletesen tanulmányozott, és hasznosnak bizonyult.
Kör RNA (circRNA) alkalmazása
CircRNA-vacsinák
Ahogy a lineáris mRNÁk, a circRNÁk is bizonyos fehérgeket termelhetnek célsejtekben és erős humorális és sejti immunválaszt indíthatnak. Némely kutatócsapat sikeresen kidolgozta a circRNA-vacsinákat a COVID-19 ellen. Az eredmények nemcsak a lineáris mRNA-vacsinák előnyeit tartalmazzák, hanem jobb stabilitást és hosszabb ideig tartó fehérgek kifejezését is mutatják, mint a lineáris mRNÁk. Ezért a circRNA-vacsinák elég nagy immunválaszt tudnak kiváltani, még alacsony dozisokon is.
Emellett néhány kutató úgy gondolja, hogy a circRNA-vacsinák, mint a következő generáció mRNA-k, jövőben hatékony eszközök lehetnek a gyakori vírusos/baktériumos betegségek és a főbb új központi fertőzések elleni küzdelemben, valamint a rák és más betegségek kezelésére is.
CircRNA a CAR/TCR-T terápiában
Kör RNA területének úttörőjeként az ORNA fejlesztette ki az in situ kimerikus antigénreceptort (CAR) terápiát az in situ terápia céljából, amely az ORN-101-et használja, egy LNP-ben zárt kör RNA-t, hogy betegek immunsejtjeit módosítsa. Az ORN-101 magas CAR kifejezést mutat egy optimalizált IRES elem vezetésével. Állati modellekben az ORN-101 tumorhatás csökkentését és megsemmisítését bizonyította be, ami azt jelenti, hogy az ORN-101-alapú antitumor terápiák befolyásolhatják a konvencionális CAR-T sejtterápiát.
Emellett Zhang stb. értékelte a kör RNA-k terápiás hatásait és alkalmazhatóságát az antigen-spesifikus T-cell receptor (TCR)-T terápiákban. Terveztek egy kör RNA-t, amely pp65-TCR-T-t kódol, amely a cytomegalovírus (CMV) pp65 epitopját célozza meg. Emellett a pp65-TCR fennállóan több mint 7 napig kifejeződött a primáris T-sejteken. Emellett a circRNA-pp65-TCR-T sejtök állandóan és speceifikusan megölték a pp65- és HLA-kifejező tumorsejtöket, és jelentősen meghosszabbították a egérök túlélési idejét.
Ezt mutatták be, hogy a pp65 circRNA-val transzfectált sejtek jobb immunválaszt fejtettek ki az egyenlítőtől valóan lineáris mRNA-hoz képest.
Yaohai Biotechnológiai-Farmaceutikai Egy Állomásból Rendelkezésre Álló CRDMO Megoldás Hosszú Kodoló RNA-ra
HU
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
