Okrągłe RNA (circRNA) odkryto po raz pierwszy jako niekodujące RNA w 1979 r.; dopiero w 2015 r. u Drosophila odkryto transkrybowane circRNA, co doprowadziło do badań nad circRNA in vitro do celów terapeutycznych i zapobiegawczych.
circRNA są samorozszerzające się i dlatego nie mają konwencjonalnej struktury, takiej jak czapeczka 5' lub ogon poliA 3'. Ta struktura czyni je bardziej stabilnymi i odpornymi na egzonukleazy, takie jak RNaza R.
Elementy struktury kolistego RNA (circRNA)
Matryca DNA do syntezy circRNA zazwyczaj obejmuje wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES), otwartą ramkę odczytu (ORF) i inne, które są krytyczne dla krążenia in vitro. Na przykład zaprojektowaliśmy plazmid jako matrycę transkryptu in vitro (IVT), który składa się z ramion homologii, 3' intronu, 3' egzonu, IRES, ORF, 5' eksonu i 5' intronu, w celu przygotowania circRNA przez samosplicowanie metody.
Wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) odgrywa ważną rolę w translacji cirRNA. Wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV) IRES, wirus Coxsackie B3 (CVB3) IRES, ludzki rinowirus B3 (HRV-B3) IRES i inne IRES są powszechnie wykorzystywane do translacji syntezy cirRNA in vitro
Cyklizacja in vivo liniowych prekursorów circRNA stanowi ważny etap w syntezie circRNA, zwykle poprzez chemiczne, enzymatyczne i szlaki samoreplikacji za pośrednictwem rybosomów. Chemiczne podejście do produkcji circRNA, znane jako kamień milowy w tej dziedzinie, zapoczątkowane w 1988 r., nie jest już obecnie stosowane ze względu na wysoki koszt, niską wydajność, dużą liczbę produktów ubocznych oraz fakt, że nadaje się wyłącznie do cyklizacji RNA o długości do 70 nukleotydów.
Enzymatyczne metody cyklizacji RNA opierają się na enzymach lub rybozymach bakteriofaga T4, takich jak ligaza DNA T4 (T4 Dnl 1), ligaza RNA T4 1 (T4 Rnl 1) i ligaza RNA T4 2 (T4 Rnl 2). Aby enzymy bakteriofaga T4 utworzyły kolisty RNA, monofosforany nukleozydów muszą znajdować się na końcu 5' i być sprzężone z grupą OH na końcu 3' RNA. Ponieważ podczas reakcji dodawane są trifosforany nukleozydów, IVT RNA zawiera trifosforan guanozyny (GTP) na końcu 5'.
Rybozymy to sekwencje RNA, które promują samosplatanie poprzez przekształcanie liniowych cząsteczek RNA w circRNA bez potrzeby stosowania dodatkowych enzymów. Proces samoorganizacji obejmuje dwie kolejne reakcje transestryfikacji w określonych miejscach, aby upewnić się, że powstają pożądane produkty cirRNA. Metoda samosplicingu intronów grupy I, znana również jako PIE (enkapsulacja intronu i eksonu), która umożliwia wytwarzanie cirRNA dłuższych niż 5 kb, została szeroko zbadana i okazała się użyteczna.
Zastosowanie okrągłego RNA (circRNA)
Szczepionki CircRNA
Podobnie jak liniowe mRNA, circRNA można przekształcić w określone białka w komórkach docelowych i wywołać silną odporność humoralną i komórkową. Ostatnio istnieje kilka zespołów badawczych, którym z powodzeniem opracowano szczepionki circRNA zapobiegające Covid-19. Ich wyniki nie tylko wykazały zalety liniowych szczepionek mRNA, ale także wykazały lepszą stabilność i dłuższy czas ekspresji białka w porównaniu z liniowym mRNA. Dlatego szczepionki circRNA mogą indukować odpowiednią odpowiedź immunologiczną nawet przy małych dawkach.
Ponadto niektórzy badacze uważają, że szczepionki circRNA, jako mRNA nowej generacji, mogą w przyszłości stać się skutecznymi narzędziami zwalczania powszechnych chorób wirusowych/bakteryjnych i głównych nowo pojawiających się chorób zakaźnych, a także leczenia raka i innych chorób.
CircRNA w terapii CAR/TCR-T
Jako pionier w dziedzinie kolistego RNA, firma ORNA opracowuje terapię in situ chimerycznego receptora antygenu (CAR) do terapii in situ, która wykorzystuje ORN-101, kolisty RNA kapsułkowany w LNP, do modulowania komórek odpornościowych u pacjentów. ORN-101 charakteryzuje się wysoką ekspresją CAR napędzaną zoptymalizowanym elementem IRES. Na modelach zwierzęcych wykazano, że ORN-101 indukuje supresję i zniszczenie guza, co sugeruje, że terapie przeciwnowotworowe oparte na ORN-101 mogą zakłócać konwencjonalną terapię komórkami CAR-T.
Ponadto Zhang i in. ocenili żywotność i skuteczność terapeutyczną circRNA w terapiach z receptorem komórek T specyficznych dla antygenu (TCR)-T. Zaprojektowali circRNA kodujący pp65-TCR-T ukierunkowany na epitop pp65 wirusa cytomegalii (CMV). Ponadto wykazano, że pp65-TCR ulega ekspresji na pierwotnych limfocytach T przez ponad 7 dni. Ponadto komórki circRNA-pp65-TCR-T specyficznie i konsekwentnie zabijały komórki nowotworowe wykazujące ekspresję pp65 i HLA i znacząco wydłużały czas przeżycia myszy.
Wykazano również, że komórki transfekowane circRNA pp65 wykazywały lepszą odpowiedź immunologiczną w porównaniu z liniowym mRNA.
Kompleksowe rozwiązanie CRDMO firmy Yaohai Bio-Pharma dla długokodującego RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NIE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
