mRNA in vitro sintēze
mRNA galvenie sastāvdaļi ir 5’-kapsula, 5’-UTR, atvērtā lasīšanas freimā (ORF), 5’-UTR un 5’ poli A repiece, kas ir būtiski, lai uzturētu mRNA funkciju. Zinātnieki ir izmantojuši dažādas metodes, lai identificētu un optimizētu mRNA sekvences un struktūras.
mRNA sintēze notiek, izmantojot in vitro transkripciju (IVT) ar lineāriem DNA veidotājiem, RNA polimerāzi (T3, T7 vai SP6), nemainīgiem vai modifiķētiem nukleotīdiem, enzīmiem un piemērotiem reagentiem.
5’ kapsulas modifikācija
Sekvences no augstākās šūnas (eukariota) veidotās mRNA parāda 7-metilsantrīn (m7G) kapsi 5' galā, kas uzlabo mRNA stabilitāti un tulkotāja efektivitāti. Ir divi galvenie veidi, kā in vitro iegūt mRNA. Pirmkārt, mRNA var būt kapsēta, pievienojot kapsas analogu ar m7GpppG struktūru (piem., CleanCap) IVT sistēmai. Šis kopā ar transkripciju notiekošais kapsēšanas process nodrošina dabisku 5' kapsas struktūru un palielina kapsēšanas efektivitāti līdz aptuveni 90-99%. Otrkārt, mRNA kartēšana var tikt izdarīta, izmantojot kartēšanas enzīma reakcijas pēc in vitro transkripcijas reakcijas.
PolyA modifikācija
Poly(A) auds arī paplašina mRNA dzīves ilgumu dzīvās šūnās un uzlabo mRNA tulkotāju efektivitāti. Palielinātā poly(A) audzes garums būtu jābūt 100-300 nukleotīdu garumā. Turklāt, modifikuētais adenosīns palielina poly A audzes stabilitāti pret šūnu RNaze degradāciju. Poly A audzi var ievietot, veicot in vitro transkripciju, izmantojot DNA veidotāja šablonu ar poly A kodēšanu, kas rezultātā iegūst specifisku poly A sekvenču garumu. Var arī izmantot rekombināto poly A polimerāzu, lai pēc mRNA transkripcijas notiktu enzimatiska poliadenilācija.
Nukleotīdu modifikācija
Modificētie nukleozīdi var inhibēt šablonu atpazīšanas receptoru (PRR) atpazīšanu un/vai aktivāciju, kā arī uzlabot mRNA vakcinu efektivitāti divos pilnīgi atšķirīgos veidos. Dažu kimiski modificētu nukleozīdu, tostarp pseudouridīna (ψ), 1-metils-pseudouridīna (m1ψ), tiouidīna (s4U) un 5-metilcitozīna (m5C), pievienošana var novērst TLR7/8 un citu inborno imūnsistēmas receptoru aktivāciju, kas nozīmīgi samazina mRNA imunogennost.
mRNA piegādes sistēma
Lai saglabātu mRNA funkciju, tai jāienāk dzimuma plazmā un jāizsaka specifiskie antigēni. Viens no galvenajiem izaicinājumiem, ar kuriem saskaras mRNA vakcīnas un terapijas, ir mRNA piegāde uzņēmēju šūnās ar pietiekami augstiem tulkotāju līmeņiem, kas prasa ļoti specifiskas un efektīvas mRNA piegādes sistēmas. Ir izstrādātas un izmantotas dažādas mRNA piegādes vektoru sistēmas, tostarp dendrītiskās šūnas (DCs), protamins, kationiskie polimeri un kationiskie liposomi.
Kationisko lipidu kompleksi ar mRNA un citiem preparātiem var kopīgi veidot 80-200 nm lielas nanoparticulas, kas saukamas par lipid nanoparticulām (LNPs). Kā viena no izstrādātākajām mRNA piegādes sistēmām, LNP ietver ionizējamos kationiskos lipīdus, dabīgos fosfolipīdus, holesterolu un polietilēnglikol (PEG). Vairāki RNA vakcīnas un terapijas (siRNA un mRNA), kas ir apstiprinātas Amerikas Savienoto Valstu Veselības un Drošības Administrācijā, balstās uz LNP piegādes sistēmām.
Yaohai Bio-Pharma piedāvā kopēju risinājumu RNA jomā
Pielāgotie sniegumi
|
Pakāpe
|
Sniedzamie rezultāti
|
Specifikācija
|
Lietojumi
|
|
nav GMP
|
Vielas, mRNA
|
0,1~10 mg (mRNA)
|
Priekškliniskie pētījumi, piemēram, šūnu transfekcija, Analītisko metožu izstrāde, Preliminarās stabilitātes pētniecības, Formulacijas izstrāde
|
|
Lekāru produkts, LNP-mRNA
|
|
GMP, Sterilitāte
|
Vielas, mRNA
|
10 mg~70 g
|
Investigational new drug (IND), Kliniskās izmēģinājumu atļauja (CTA), Kliniskās izmēģinājumu piegāde, Bioloģiskā licences pieteikums (BLA), Komercpiiegāde
|
|
Lekāru produkts, LNP-mRNA
|
5000 flakoni vai uzpildītas siringas/ kartidges
|
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
