Apļveida RNA (circRNA)

Modalitāte

Cikliskās RNA (circRNA) tika atklātas kā nekodējošas RNA 1979. gadā; tikai 2015. gadā transkribētās circRNA tika uzrakstītas Drosophilā, kas veicināja in vitro circRNA pētījumus terapeutiskajiem un profilakses mērķiem.

circRNA ir pašizplejošās un tādēļ nemaz nav konvenčuāla struktūras, piemēram, 5' kapas vai 3' poliA repes. Šāda struktūra padara tos stabilākus un rezistentākus pret eksonukleāzi, piemēram, RNase R.

Cikliskās RNA (circRNA) struktūras elementi

CircRNA sintēzes šablonDNA parasti ietver iekšējo ribozoma ieejas vietu (IRES), atvērto lasīšanas freimu (ORF) un citus elementus, kas ir būtiski in vitro cirkulācijai. Piemēram, mēs izstrādājām plazmidu kā in vitro transkripcijas (IVT) šablonu, kas sastāv no homoloģiskajām rokām, 3’ intronam, 3’ exonam, IRES, ORF, 5’ exonam un 5’ intronam, lai sagatavotu circRNA pašspalīšanas metodes palīdzībā.

Iekšējais ribosomas ieejas vietu (IRES) izpilda svarīgus lomu cirRNA tulkošanā. Encefalomijokardīta virusa (EMCV) IRES, coxsackievirusa B3 (CVB3) IRES, cilvēka rinovīra B3 (HRV-B3) IRES un citi IRES bieži tiek izmantoti cirRNA vitro sintezei tulkošanai.

In vivo ciklizācija circRNA lineārām precursorsniedz svarīgu soli circRNA sintezē. Parasti tā notiek caur hīmiskiem, enzimiskiem un ribosoma mediētiem pašreplikācijas ceļiem. Zināms kā jomas piemineklis, hīmiskais metodes circRNA ražošanai, kas sākās 1988. gadā, vairs nav izmantots šodien dēļ tā augstās izmaksas, zemas ražotspējas, liela daudzuma blīvproduktu un tā, ka tas ir piemērots tikai RNA ciklizācijai līdz 70 nukleotīdu garumam.

Eižimātiskie metodi RNA ciklizēšanai balstīti uz bakteriofāga T4 enzīmiem vai ribozīmiem, piemēram, T4 DNA ligazē (T4 Dnl 1), T4 RNA ligazē 1 (T4 Rnl 1) un T4 RNA ligazē 2 (T4 Rnl 2). Lai izveidotu ciklisko RNA ar T4 bakteriofāga enzīmiem, nukleozīdu monofosfāti jāatrodas 5' galā un jākonjugē ar OH grupu RNA 3' galā. Tā kā reakcijā tiek pievienoti nukleozīdu trifosfāti, IVT RNA satur guanīna trifosfātu (GTP) 5’ galā.

Ribozīmi ir RNA sekas, kas veicina savstarpējo splicingu, pārvēršot lineāros RNA molekulas par circRNA bez papildu enzīmu nepieciešamības. Savaizmantošanas process ietver divus secīgi notiekošos transesterifikācijas reakciju posmus specifiskos vietos, lai nodrošinātu vajadzīgo cirRNA produktu veidošanos. Pirmās grupas intronu savstarpējais splicinga process, kas pazīstams arī kā PIE (introna un ekstrona ietilpīšana), kas ļauj ražot cirRNA garākas par 5 kb, ir intensīvi pētīts un pierādījis savu noderību.

Cikliskās RNA (circRNA) pielietojums

CircRNA vakcīnas

Kā lineārās mRNAs, cirkulārās RNA var tikt pārvērstas par noteiktiem proteīniem mērķa šūnās un izraisīt stipru humorālo un šūnu imunitāti. Nesen daži zinātnieku komandu veiksmīgi izstrādāja circRNA vakcīnas pret COVID-19. To rezultāti ne tikai ietver lineārās mRNA vakcīnu priekšrocības, bet arī piedāvā labāku stabilitāti un garāku proteīnu izpausmi salīdzinājumā ar lineāro mRNA. Tāpēc circRNA vakcīnas spēj izraisīt pietiekamu imūnreakciju pat zemās dozēs.

Piedzīvojumi liecina, ka daži pētnieki uzskata, ka circRNA vakcīnas, kā nākamā paaudze mRNAs, var kļūt par efektīviem rīkiem nākotnē cīņā pret parastajām vīrusu/bakteriālajām slimībām un galvenajām jauno infekciju slimībām, kā arī pret rakstu un citām slimībām.

CircRNA CAR/TCR-T terapijā

Kā pionieris cikliskās RNA jomā, ORNA ir attīstījusi terapijas vietējā imūnreakcijas modifikāciju (CAR) vietējai terapeiitiskai izmantošanai, izmantojot ORN-101, ciklisko RNA, kas ietverta LNP kapsulā, lai regulētu pacientu imūnceli. ORN-101 parāda augstu CAR izpausmi, kuru nodrošina optimizēts IRES elements. Zvēru modelos tika parādīts, ka ORN-101 var izraisīt tumora sagriešanu un zudumu, kas liecina, ka ORN-101 bāzētās prettumora terapijas var konkurēt ar tradicionālo CAR-T limfocitu terapiju.

Papildus tam, Zhang un kolēģi novērtēja cirkuļāras RNA dzīvību un terapeutisko efektivitāti antigēna-specifiskajā T-limfocītu receptoru (TCR)-T terapijā. Tie dizainēja cirkuļāro RNA, kas kodē pp65-TCR-T, kas mērķtiecīgi reaģē uz pp65 epitopu citomegalovīrusam (CMV). Turklāt tika parādīts, ka pp65-TCR tiek izteikts uz primārajām T-limfocītu līdz vairākiem dienām. Papildus, circRNA-pp65-TCR-T limfocīti specifiski un konsekventi nogalināja tumora limfocītus, kas izpauda pp65 un HLA, un nozīmīgi pagarināja pelēkiešu dzīves ilgumu.

Tika parādīts, ka šūnas, kas transfekcijas metodes palīdzībā ieguvušas pp65 circRNA, parādīja labākus imūnsistēmas atbildes salīdzinājumā ar lineāru mRNA.