Cikliniai RNA (circRNA) pirmą kartą buvo atskleisti kaip nekoduojantys RNA 1979 metais; tik 2015 metais buvo rasti transkribuojami circRNA drosofilėse, o tai sukėlė in vitro circRNA tyrimus terapijos ir prevencijos tikslais.
circRNA yra savarankiškai išplėstiniai ir todėl neturi konvencinio struktūros, tokios kaip 5' šlapto arba 3' polyA uodego. Ši struktūra jų daro stabilesnius ir pasipriežtintesnius prie exonukleazų, pvz., RNase R.
Ciklinio RNA (circRNA) struktūros elementai
CircRNA sintezės šabloninis DNA paprastai apima vidaus ribosomo įėjimo vietą (IRES), atvirojo skaitimo lango (ORF) ir kitus, kritinius in vitro cirkuliacijai. Pavyzdžiui, mes sukūrėme plazmidą kaip in vitro transkripcijos (IVT) šabloną, kuris sudarytas iš homologinių rankų, 3’ introno, 3’ ekono, IRES, ORF, 5’ ekono ir 5’ introno, kad pagamintume circRNA savarankiškai splicing metodu.
Vidinė ribosomoje įeities vieta (IRES) atlieka svarbias funkcijas cirRNAs vertimui. Encefalomiokarditido viruso (EMCV) IRES, coxsackieviruso B3 (CVB3) IRES, žmogaus rinoviruso B3 (HRV-B3) IRES ir kitos IRES dažnai yra naudojamos vitro sintezės cirRNA vertimui.
In vivo ciklinis circRNA linijinių prekursorių etapas yra svarbus circRNA sintezės procese, paprastai per chemines, enzymines ir ribosomos pagreitintas savireplikacijos kelią. Cheminis circRNA gamybos metodas, pradėtas 1988 metais, laikomas srities landmarku, jis šiandien nebeleidžiamas dėl aukštos kainos, mažos gręžties, didelio priešproduktų skaičiaus ir to, kad jis yra tinkamas tik RNA ciklizacijai iki 70 nukleotidų ilgio.
Enzymatic methods for cyclizing RNA yra pagrįstos bakteriofago T4 enzymų arba ribozimų, pavyzdžiui, T4 DNA ligazės (T4 Dnl 1), T4 RNA ligazės 1 (T4 Rnl 1) ir T4 RNA ligazės 2 (T4 Rnl 2). Norint sukurti ciklinę RNA naudojant T4 bakteriofago enzymus, nukleozidinių monofosfatų turi būti esama ant 5' galo ir jie turi būti jungiami su OH grupiu ant 3' galą RNA. Kadangi reakcijoje pridedami nukleozidiniai trifosfatai, IVT RNA turės guanозinio trifosfato (GTP) ant 5’ galio.
Ribozimai yra RNA sekos, kurios skatina savaiminį splicingą, konvertuojant tiesines RNA molekules į circRNA be papildomų enzymų poreikio. Savaiminis montavimas vyksta per du sekantinius transesterifikacijos veiksmus tam tikruose vietose, kad būtų užtikrintas norimos cirRNA produktų formavimas. Pirmosios klasės introno savaiminis splicingas, taip pat žinomas kaip PIE (introno ir eksono apdengimas), kuris leidžia gaminti ilgesnius nei 5 kb cirRNA, buvo išsamiai tyrinėtas ir įrodytas naudingas.
Circularinio RNA (circRNA) taikymas
CircRNA vakcinos
Tarsi tiesiniai mRNA, circRNA gali būti konvertuojami į tam tikrus proteinus tiksliniuose ląstelėse ir sukelti stiprią humoralinę ir ląstelių imuninę atsaką. Nesenai kai kurie tyrimų komandos sėkmingai sukūrė circRNA vakcinas, skirtas prevencijai nuo COVID-19. Jų rezultatai ne tik turėjo tiesinio mRNA vakcinos privalumus, bet ir buvo charakterizuojami geresne stabilumu bei ilgesniu proteino išraiškos laiku nei tiesinis mRNA. Todėl circRNA vakcinos gali sukelti pakankamą imuninę atsaką net mažais doziais.
Be to, kai kurie mokslininkai manoma, kad circRNA vakcinos kaip kartopuočiai mRNA ateityje gali tapti veiksmingais įrankiais kovojant su paplitusiomis virusinėmis/bakterinėmis ligomis ir pagrindiniais naujais infekciniais liga, taip pat vartojamos vėžio ir kitų ligų gydymui.
CircRNA CAR/TCR-T terapijoje
Kaip pionierė krikolinių RNA srityje, ORNA kūrė vietinę himerinio antigeno receptoriaus (CAR) terapiją vietinei terapijai, naudojant ORN-101, LNP apdengtą krikolinę RNA, kad reguliuotų imunines ląstas pacientuose. ORN-101 rodo aukštą CAR išraišką, kuriai valdo optimizuotas IRES elementas. Gyvūnų modeliuose buvo parodyta, kad ORN-101 gali sukeliauti vamzdžių stebėjimą ir sunaikinimą, tai reiškia, kad ORN-101 pagrįsta antivandens terapija gali sutrikdyti konvencinę CAR-T ląstelių terapiją.
Be to, Zhang ir kt. įvertino gyvybingumą ir terapeutinę veiksmingumą cirkulinėse RNA, naudojamose antigeno specifiniame T-ląstelės receptoriaus (TCR)-T terapijoje. Jie sukūrė cirkulinę RNA, koduojančią pp65-TCR-T, nukreiptą į cytomegalo viruso (CMV) pp65 epitopą. Be to, buvo parodyta, kad pp65-TCR yra išreiškiamas pirminėse T ląstelėse daugiau nei 7 dienas. Be to, circRNA-pp65-TCR-T ląstelės specifiai ir nuolat sunaikino pp65 ir HLA išreikštas vamzdžių ląstes bei didžiai prilygino pelės gyvenimo trukmę.
Taip pat buvo parodyta, kad ląstelės, transfekuotos pp65 circRNA, rodė geresnius imuninius atsakius palyginti su linijine mRNA.
Yaohai Bio-Pharma vienvietė sprendimas CRDMO ilgo koduojančiam RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
