Tsirkulaarsed RNA-d (circRNA-d) avastati esmakordselt mittekodeerivate RNA-dena 1979. aastal; alles 2015. aastal leiti Drosophilast transkribeeritud tsirRNA-sid, mis viis in vitro tsirRNA-de uurimiseni terapeutilistel ja ennetavatel eesmärkidel.
tsircRNA-d on iselaienevad ja seetõttu puudub neil tavapärane struktuur, näiteks 5' kork või 3' polüA saba. See struktuur muudab need stabiilsemaks ja vastupidavamaks sellistele eksonukleaasidele nagu RNaas R.
Tsirkulaarse RNA (circRNA) struktuurielemendid
TsirkulRNA sünteesi jaoks mõeldud matriitsi DNA sisaldab tavaliselt sisemist ribosoomi sisenemissaiti (IRES), avatud lugemisraami (ORF) ja teisi, mis on in vitro tsirkulatsiooni jaoks kriitilised. Näiteks konstrueerisime plasmiidi in vitro transkripti (IVT) matriitsina, mis koosneb homoloogiaharust, 3' intronist, 3' eksonist, IRES-ist, ORF-ist, 5' eksonist ja 5' intronist, et valmistada tsirRNA ise splaissimise teel. meetodid.
Sisemine ribosoomi sisenemise sait (IRES) täidab cirRNA-de translatsioonis olulist rolli. Entsefalomüokardiidi viiruse (EMCV) IRES-i, koksakiviiruse B3 (CVB3) IRES-i, inimese rinoviiruse B3 (HRV-B3) IRES-i ja teisi IRES-i on tavaliselt kasutatud tsirRNA-de vitro sünteesi translatsiooniks.
TsirkulRNA lineaarsete prekursorite in vivo tsüklistamine on oluline samm tsirkulRNA sünteesis, tavaliselt keemiliste, ensümaatiliste ja ribosoomide vahendatud isereplikatsiooniradade kaudu. Valdkonnas verstapostina tuntud keemiline lähenemisviis tsircRNA tootmiseks, mis pärineb 1988. aastast, ei ole tänapäeval enam kasutusel, sest see on kõrge hind, madal saagis, suur hulk kõrvalsaadusi ja asjaolu, et see sobib ainult tsüklistamiseks. RNA-d pikkusega kuni 70 nukleotiidi.
Ensümaatilised meetodid RNA tsüklistamiseks põhinevad bakteriofaagi T4 ensüümidel või ribosüümidel, nagu T4 DNA ligaas (T4 Dnl 1), T4 RNA ligaas 1 (T4 Rnl 1) ja T4 RNA ligaas 2 (T4 Rnl 2). Ringliku RNA moodustamiseks T4 bakteriofaagi ensüümide abil peavad nukleosiidmonofosfaadid paiknema RNA 5'-otsas ja konjugeerima OH-rühmaga RNA 3'-otsas. Kuna reaktsiooni käigus lisatakse nukleosiidtrifosfaate, sisaldab IVT RNA 5' otsas guanosiintrifosfaati (GTP).
Ribosüümid on RNA järjestused, mis soodustavad isesplaissimist, muutes lineaarsed RNA molekulid tsirkRNA-ks, ilma et oleks vaja täiendavaid ensüüme. Isekoostumisprotsess hõlmab kahte järjestikust ümberesterdamisreaktsiooni konkreetsetes kohtades, et tagada soovitud cirRNA produktide moodustumine. I rühma introni isesplaisingu meetodit, mida tuntakse ka kui PIE (intron and exon encapsulation), mis võimaldab toota tsirRNA-sid, mis on pikemad kui 5 kb, on põhjalikult uuritud ja see on osutunud kasulikuks.
Tsirkulaarse RNA (circRNA) rakendamine
CircRNA vaktsiinid
Sarnaselt lineaarsetele mRNA-dele saab tsirkRNA-sid sihtrakkudes muundada teatud valkudeks ja indutseerida tugeva humoraalse ja rakulise immuunsuse. Hiljuti on mõned uurimisrühmad edukalt välja töötanud tsirkulRNA vaktsiinid, et vältida COVID-19. Nende tulemused ei ole mitte ainult omanud lineaarsete mRNA vaktsiinide eeliseid, vaid neil on ka parem stabiilsus ja pikem valgu ekspressiooni kestus kui lineaarne mRNA. Seetõttu võivad tsirkRNA vaktsiinid isegi väikeste annuste korral esile kutsuda piisava immuunvastuse.
Lisaks arvavad mõned teadlased, et tsirkRNA vaktsiinid kui järgmise põlvkonna mRNA-d võivad tulevikus saada tõhusateks vahenditeks tavaliste viirus-/bakteriaalsete haiguste ja peamiste esilekerkivate nakkushaiguste vastu võitlemisel, samuti vähi ja muude haiguste ravis.
CircRNA CAR / TCR-T teraapias
Tsirkulaarse RNA valdkonnas teerajajana on ORNA välja töötanud in situ kimäärse antigeeni retseptori (CAR) teraapiat in situ ravi jaoks, mis kasutab patsientide immuunrakkude moduleerimiseks ORN-101, LNP-sse kapseldatud tsirkulaarset RNA-d. ORN-101 esitleb optimeeritud IRES-elemendi poolt juhitava CAR kõrget väljendust. Loommudelites näidati, et ORN-101 indutseerib tuumori supressiooni ja hävitamist, mis viitab sellele, et ORN-101-põhised vähivastased ravimeetodid võivad segada tavapärast CAR-T-rakuteraapiat.
Lisaks Zhang et al. hindas tsircRNA-de elujõulisust ja terapeutilist efektiivsust antigeenispetsiifilise T-raku retseptori (TCR)-T ravis. Nad kujundasid tsirkulRNA, mis kodeeris pp65-TCR-T, mis oli suunatud tsütomegaloviiruse (CMV) pp65 epitoopi. Lisaks on näidatud, et pp65-TCR ekspresseerub primaarsetel T-rakkudel üle 7 päeva. Lisaks tapsid tsircRNA-pp65-TCR-T rakud spetsiifiliselt ja järjekindlalt pp65- ja HLA-d ekspresseerivaid kasvajarakke ning pikendasid oluliselt hiirte ellujäämisaega.
Samuti näidati, et pp65 tsirkRNA-ga transfekteeritud rakkudel oli parem immuunvastus võrreldes lineaarse mRNA-ga.
Yaohai Bio-Pharma ühekordne CRDMO lahendus pika kodeeriva RNA jaoks
ET
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
EI
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
