Ringmõistes RNA (circRNA) on laialdaselt kasutatud gene või proteiini funktsioonide uurimisel. Samal ajal on see populaarne ennetavate ja raviatavate bioloogiliste toodete arendamisel, sarnaselt mRNA-ga.
Yaohai Bio-Pharma on loonud circkRNA sünteesitehnoloogia komplekti kvaliteetse RNA tootmiseks, nagu järjestuse disain ja optimeerimine, in vitro transkriptioon (IVT), ringlustamine/ringlus, puhastamine ning lipiidnanopartikli (LNP) kapsuleerimine. Kõik tooted väljastatakse rangete kvaliteedikontrolli (QC) standartidest läbi.
Võrreldes lineaarse mRNA-ga on ringiline RNA (circRNA) struktuuris stabiilsem ning see on praegu suurepärane uuringupunkt nukleeiinacidiravi uurimises. Sellel on laias ulatuses rakendusi erinevates valdkondades, kasutatakse see ka koodiva circRNA või mittekoodiva circRNA naardi, sealhulgas infektsioonsete haiguste ennetavate vaktsiinate, rakkide ravimise vaktsiinate, rakkide ravimise preparaatide, proteiini asendusrahi, regeneratiivse arstiteaduse, rakkide ja geneetilise ravi (CGT), molekulaarspongi rolli ja RNA aptameri korral.
Protsess | Valikuline teenus | Teenuste üksikasjad | Toimetamisperiood (päev) |
circRNA jada disain ja optimeerimine | Koodivate jadade kujundamine ja optimeerimine | CDS kodooni optimeerimine | 1 |
Mittekodeerivate jadade kujundamine ja optimeerimine | Introoni ja eksjooni jada, homoloogne kael ja vahekaalu disain ja optimeerimine | 1-2 | |
Ringplasimidito ettevalmistamine | Geeni süntees | Geeni süntees (kolmandate poolte poolt) | 7-10 |
Plasmidi amplifitseerimine | Plasmidi amplifitseerimine | 2 | |
Plasmidi ekstraktioon | |||
Lineaarse plasmidi ettevalmistamine | Plasmidi lineaarne tegemine ja puhastamine | Plasmidi lineaarneks tegemine | 1 |
DNA lineaarsete osade puhastamine | |||
In vitro transkriptsioon ja tsükliseerimine | In vitro transkriptsioon ja tsükliseerimine | In vitro transkriptsioon ja tsükliseerimisreaktsioonid | 1-2 |
RNase R digeerimine | |||
Optimeerimine – valikuline | Reaktsiooni koostis, aja optimeerimine | 2-5 | |
circRNA puhasdamine | Tavaline puhastusmeetod | Liivhloriidipõhine沉淀 | 1 |
Magnetsete pallide purifikatsioon | 1 | ||
Ülemalt puhta circRNA puhastus | Ettevalmistamiseks ülajõudeline vedelkromaatograafia (HPLC) | 1-2 | |
Puhveri vahetus | Ültrasidusfilterdamine | 1 | |
circRNA lüöösimine | Näidis täitmine | Täitmine | 2-3 |
Lüöfiliseerimine | Eelsoojendamine | ||
Esmane kuivatus (sublimatsioon) | |||
Teisene kuivatus (desorptsioon) | |||
circRNA-LNP enkapsuleerimine | LNP enkapsuleerimine | Materjalide ja vedelike eeltoitlus | 2 |
Mikrofluusi seadme segamine | |||
Puhveri vahetus | Tangentsiaalne Voolufiltratsioon | 1 | |
Steriliseerimine | Filtratsioon | ||
Plasmid-DNA kvaliteedikontroll | Konsoentratsioon/puhasus | Ultraviolet (UV) spektroofotomeetria | 1-2 |
Plasmidikonformatsioon | Agaarosegelei elektroforees (AGE) | ||
Kapillaareelektrofoorees (CE)-valikuline | |||
Plasmidi identifitseerimine | Piiranguenzymide identifitseerimine/AGE | ||
CircRNA kvaliteedikontroll | Konsoentratsioon/puhasus | Ultraviolet (UV) spektroofotomeetria | - |
Puhtus | Agarosegelei elektrofoorees (AGE)/E-Gel | 0.5 | |
HPLC-valikuline | 1 | ||
Kvaliteedi kontroll circRNA-LNP korral | Enkapsuleerimise tõhusus | RiboGreen meetod | 1 |
Hapukootsu suurus | Dünaamiline valgustusskatteerumine (DLS) | 1 | |
Polüdispersiivne indeks | Dünaamiline valgustusskatteerumine (DLS) | 1 | |
Zeta-potentiaal | Dünaamiline valgustusskatteerumine (DLS) | 1 | |
Keelatud potentsuse analüüs | Keelatud transfektsoon | Keelatud plaatimine, keelatud transfektsoon | 4 |
Sihtproteini tuvastamine | Floresentsiooni vaatamine, Läänispliid/EELISA | 1-3 |
Me transfeerisime tugevustatud rohelise floresentsiaalsete protseedi ringjoonkuju (eGFP circRNA), mCherry circRNA, luciferaasi circRNA 293T rakudesse ning tuvastasime sihtprotseedi floresentsi, luminestsentsi või värvi signaalide kaudu, läänispliidiga (WB), enzyymi-lingitud immunossorbentsiasoossiga (ELISA).
Yaohai Bio-Pharma poolt tehtud ringjoonkuju näidiste potentsuse rakuusilised analüüsid