In vitro-syntes av mRNA
De huvudsakliga komponenterna i mRNA är 5’-cap, 5’-UTR, öppen läsram (ORF), 5’-UTR och 5’ poly A svans, vilka är nödvändiga för att underhålla mRNA-funktionen. Forskare har använt en mängd metoder för att identifiera och optimera mRNA-sekvenser och strukturer.
mRNA-syntesen utförs på basis av in vitro transkription (IVT) med linjära DNA-mallar, RNA-polymerasor (T3, T7 eller SP6), okorrigerade eller korrigerade nukleotider, enzym och lämpliga reaktanter.
5’ Cap Modifiering
Sekvenserna av mogna mRNA från eukaryocyt visar en 7-metylguanosin (m7G)-kappe vid det 5’-endet, vilket förbättrar mRNA-stabiliteten och translations-effektiviteten. Det finns två allmänna metoder för att fånga mRNA in vitro. För det första kan mRNA kapsas tillsammans med in vitro-transkriptionen genom att lägga till en kapsanalog av m7GpppG-strukturen (t.ex., CleanCap) till IVT-systemet. Denna samtidiga transkriptions- och kapsningsmetod ger en naturlig 5'-kapselstruktur och ökar kapsningseffektiviteten till nästan 90-99%. För det andra kan mRNA-kartläggning också utföras genom enzymreaktioner efter in vitro-transkriptionsreaktionen.
PolyA-modifikation
Poly(A)-svansen föränger också halvtiden för mRNA in vivo och förbättrar översättningseffektiviteten av mRNA. Längden på den förstärkta poly(A)-svansen bör vara 100-300 nukleotider. Dessutom ökar modifierat adenosin stabiliteeten hos poly A-svansen mot nedbrytning av cellulära RNasen. Poly A-svans kan infogas genom in vitro-transkription med hjälp av en DNA-mall som kodar för poly A, vilket resulterar i en specifik längd på poly A-sekvensen. Recombinant poly A-polymeras kan också användas genom enzymatisk polyadenylation efter mRNA-transkription.
Nukleotider Modification
Modifierade nukleosider kan inhibera känsligheten och/eller aktiveringen av mönsterigenkännande receptorer (PRR) och förbättra effektiviteten av mRNA-vacciner på två helt olika sätt. Tillägget av vissa kemiskt modifierade nukleosider, inklusive pseudouridin (ψ), 1-metyl-pseudouridin (m1ψ), tiouridin (s4U) och 5-metylcytosin (m5C), kan förebygga aktivering av TLR7/8 och andra innate immunt receptorer, vilket betydligt minskar immunogeniteten hos mRNA.
Leveranssystem för mRNA
För att bibehålla funktionen hos mRNA måste den komma in i värdcytoplasman och uttrycka specifika antigener. En av de största utmaningarna för mRNA-vacciner och terapeutiska medel ligger i att leverera mRNA till målceller med tillräckligt höga översättningsskalor, vilket kräver mycket specifika och effektiva leveranssystem för mRNA. Flera mRNA-leveransvektorer har utvecklats och används, inklusive dendritiska celler (DCs), protamin, kationiska polymerer och kationiska liposomer.
Komplexer av kationiska lipider med mRNA och andra förberedelser kan tillsammans bildas till nanopartiklar på 80-200 nm i storlek, som kallas lipidnanopartiklar (LNPs). Som ett av de mest avancerade systemen för leverans av mRNA inkluderar LNP ioniserbara kationiska lipider, naturliga fosfolipider, cholesterol och polyetylen glykol (PEG). Flera RNA-vacciner och terapiersystem (siRNA och mRNA) som godkänts av U.S. Food and Drug Administration bygger på LNP-leveranssystem.
Yaohai Bio-Pharma erbjuder allt-ihop-lösning för RNA
Anpassade leveranser
Kvalitet
|
Leveranser
|
Specificitet
|
Tillämpningar
|
icke-GMP
|
Verksamhet, mRNA
|
0,1~10 mg (mRNA)
|
Förklinisk forskning som celltransfektion, Utveckling av analytiska metoder, Förstabilitetsstudier, Formuleringsutveckling
|
Läkemedelsprodukt, LNP-mRNA
|
GMP, Sterilitet
|
Verksamhet, mRNA
|
10 mg~70 g
|
Sökande om nytt läkemedel (IND), Tillstånd för kliniska provningar (CTA), Försörjning av kliniska provningar, Tillstånd för biologiska produkter (BLA), Kommerciell försörjning
|
Läkemedelsprodukt, LNP-mRNA
|
5000 flaskor eller färdiga injektionssprutor/ karuseller
|