Circular RNAs (circRNAs) upptäcktes först som icke-kodande RNAs år 1979; det var inte förrän 2015 som transkriberade circRNAs hittades i Drosophila, vilket ledde till studier av in vitro circRNAs för terapeutiska och preventiva ändamål.
circRNAs är självtillväxtiga och har därför ingen konventionell struktur som en 5' kap eller 3' polyA svans. Denna struktur gör dem mer stabila och motståndskraftiga mot exonukleaser som RNase R.
Strukturella element hos Circular RNA (circRNA)
Mall-DNA för circRNA-syntes inkluderar vanligtvis intern ribosomindatringsplats (IRES), öppen läsramma (ORF) och andra som är avgörande för in vitro-cirkulation. Till exempel designade vi en plasmid som mall för in vitro-transkription (IVT), som består av homologiarmer, 3’ intron, 3’ exon, IRES, ORF, 5’ exoner och 5’ intron, för att förbereda circRNA med hjälp av själva splicingmetoder.
Intern Ribosom Entry Site (IRES) utför viktiga roller i översättningen av cirRNAs. Encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, human rhinovirus B3 (HRV-B3) IRES och andra IRES har vanligtvis använts för översättningen av den vitro-syntesen av cirRNAs.
In vivo-cykling av circRNA-linjära föregångare ger en viktig steg i circRNA-syntesen, vanligen genom kemiska, enzymatiska och ribosom-medierade självafterlikningsvägar. Känd som en milstolpe inom området, den kemiska metoden för circRNA-produktion, som utvecklades 1988, används inte längre idag på grund av dess höga kostnad, låga utbyte, stort antal bifärvar och det faktum att den endast är lämplig för cykling av RNAs upp till 70 nukleotider i längd.
Enzymtiska metoder för att cirkulera RNA baseras på bakteriofag T4-enzym eller ribozomer, såsom T4 DNA-ligas (T4 Dnl 1), T4 RNA-ligas 1 (T4 Rnl 1) och T4 RNA-ligas 2 (T4 Rnl 2). För att skapa cirkulär RNA med T4-bakteriofagenzym måste nukleotidmonofosfat vara placerade på 5' änden och konjugerade till OH-gruppen på 3' änden av RNA. Eftersom nukleotidtrifosfat läggs till under reaktionen innehåller IVT-RNA guanosintrifosfat (GTP) på 5’ änden.
Ribozomer är RNA-sekvenser som främjar självsplicing genom att omvandla linjär RNA till circRNA utan behov av ytterligare enzym. Själva sammansättningsprocessen involverar två på varandra följande transesterifieringsreaktioner på specifika platser för att säkerställa att de önskade cirRNA-produkterna bildas. Grupp I intron självsplicing-metoden, även känd som PIE (intron och exon inkapsling), som möjliggör produktionen av cirRNAs längre än 5 kb, har utforsrats ingående och visat sig vara användbar.
Användning av cirkulär RNA (circRNA)
CircRNA-vacciner
Likt linjära mRNAs kan circRNAs omvandlas till vissa proteiner i målceller och utlösa en stark humör- och cellbaserad immunitet. Nyligen har flera forskargrupper framgångsrikt utvecklat circRNA-vacciner för att förebygga COVID-19. Deras resultat har inte bara haft fördelarna hos linjära mRNA-vacciner, utan också visat en bättre stabilitet och längre varaktighet för proteinetablering än linjär mRNA. Därför kan circRNA-vacciner utlösa tillräckliga immunsvar även vid låga doser.
Dessutom anser vissa forskare att circRNA-vacciner, som nästa generations mRNAs, kan bli effektiva verktyg i framtiden för att bekämpa vanliga virus-/bakteriella sjukdomar och stora nyupptäckta infektiösa sjukdomar, samt för behandling av cancer och andra sjukdomar.
CircRNA i CAR/TCR-T-terapi
Som pionjär på området för cirkulär RNA har ORNA utvecklat CAR-terapi (chimerisk antigenreceptor) in situ för en lokal behandling som använder ORN-101, en cirkulär RNA inkapslad i LNP, för att modifiera immunceller hos patienter. ORN-101 visar hög expression av CAR drivet av ett optimerat IRES-element. I djurförsök visade ORN-101 sig kunna inducera tumörundertryckning och förstöring, vilket tyder på att ORN-101-baserade anticancerterapier kan interferera med konventionell CAR-T-cellterapi.
Utöver detta utvärderade Zhang et al. överlevnadsförmågan och terapeutiska effekten av circRNA i antigen-spesifika T-cell receptor (TCR)-T-terapierna. De designade en circRNA kodande för pp65-TCR-T riktad mot pp65-epitopet hos cytomegalvirus (CMV). Dessutom har pp65-TCR visats uttryckas på primära T-celler i över 7 dagar. Dessutom dödade circRNA-pp65-TCR-T-celler specifikt och konsekvent tumörceller som uttryckte pp65 och HLA och betydligt förlängde musarnas överlevnads tid.
Det visades också att celler som transfekterats med pp65 circRNA utvisade bättre immunsvar jämfört med linjär mRNA.
Yaohais Bio-Pharma Enskild CRDMO-lösning för Långkodande RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
