In vitro-syntese av mRNA
De viktigste komponentene i mRNA er 5’-cap, 5’-UTR, åpen lesingsramme (ORF), 3’-UTR og 5’ poly A-hale, som er nødvendige for å opprettholde mRNA-funksjonen. Forskere har brukt en rekke metoder for å identifisere og optimalisere mRNA-sekvenser og strukturer.
Syntesen av mRNA gjøres på grunnlag av in vitro-transkript (IVT) ved bruk av lineære DNA-mal, RNA-polymerasen (T3, T7 eller SP6), unmodifiserte eller modifiserte nukleotider, enzym og tilpassede reaktanter.
5’ Cap-modifisering
Sekvensene av moden mRNA fra eukaryocyt viser en 7-metylguanosin (m7G)-kappe på det 5’-enden, som forbedrer stabiliteten til mRNA og translasjons-effektiviteten. Det finnes to generelle metoder for å fange mRNA in vitro. Først kan mRNA kaptes sammen med in vitro-transkript ved å legge til en kap-analog av m7GpppG-strukturen (f.eks., CleanCap) i IVT-systemet. Denne ko-transkripsjonelle kappemetoden gir en naturlig 5'-kapselstruktur og øker kapp-effektiviteten til nesten 90-99%. Andre kan mRNA-kartlegging også gjøres ved å bruke kartleggingsenzyme etter in vitro-transkripsjonsreaksjonen.
PolyA-modifikasjon
Poly(A)-hale forlenger også halveringen av mRNA i levende organismen og forbedrer translasjons-effektiviteten av mRNA. Lengden på den amplifiserte poly(A)-hale bør være 100-300 nukleotider. I tillegg øker modifisert adenosin stabilheten til poly A-halen mot nedbryting av cellulære RNase. Poly A-hale kan settes inn ved in vitro-transkripsjon ved bruk av en DNA-mal som koder for poly A, noe som fører til en spesifikk lengde på poly A-sekvensen. Rekombinant poly A-polymerase kan også brukes ved enzymatisk polyadenylering etter transkripsjon av mRNA.
Nukleotid-modifikasjon
Modifiserte nukleosider kan hindre mønsterkjenningsreseptorer (PRR) i å oppdage og/eller aktiveres, og forbedre effektiviteten av mRNA-vaksiner på to helt forskjellige måter. Tilleggingen av visse kjemisk modifiserte nukleosider, blant annet pseudouridin (ψ), 1-metyl-pseudouridin (m1ψ), tiouridin (s4U) og 5-metylcytosin (m5C), kan forhindre aktivering av TLR7/8 og andre innfødte immuneresepctorer, noe som betydelig reduserer den immunogenitet av mRNA.
leveringssystem for mRNA
For å opprettholde funksjonen til mRNA, trenger det å komme inn i vertens sitoplasma og uttrykke spesifikke antigener. En av de største utfordringene ved mRNA-vaksiner og -terapier ligger i å levere mRNA til målceller med tilstrekkelig høy oversettelsesnivå, noe som krever ypperst spesifikke og effektive leveringssystemer for mRNA. Flere mRNA-leveringsvektorer har blitt utviklet og brukt, inkludert dendritiske celler (DCs), protamin, katyoniske polymerer og katyoniske liposomer.
Komplekser av katjoniske lipid med mRNA og andre forberedelser kan sammen danne nanopartikler på 80-200 nm størrelse, kalt lipid nanopartikler (LNPs). Som en av de mest avanserte mRNA-leveringssystemene inkluderer LNP ioniserbare katjoniske lipid, naturlige fosfolipid, kolesterol og polyetylen glykol (PEG). Flere RNA-vaksiner og -terapier (siRNA og mRNA) som er godkjent av den amerikanske Food and Drug Administration bygger på LNP-leveringssystemer.
Yaohai Bio-Pharma Tilbyr Enestående Løsning for RNA
Tilpassede Leveransekriterier
Kvalitet
|
Leveringsvarer
|
Spesifikasjon
|
Anvendelser
|
ikke-GMP
|
Råstoff, mRNA
|
0,1~10 mg (mRNA)
|
Forstudie forskning som celletransfeksjon, Analytisk metodeutvikling, Forstabilitetsstudier, Formuleringsutvikling
|
Legemiddelprodukt, LNP-mRNA
|
GMP, Sterilitet
|
Råstoff, mRNA
|
10 mg~70 g
|
Søknad om nytt legemiddel (IND), Godkjenning av kliniske prøver (CTA), Forsyning til kliniske prøver, Søknad om biologisk lisens (BLA), Kommersiell forsyning
|
Legemiddelprodukt, LNP-mRNA
|
5000 flasker eller prefylte sprøytekker/ karrierer
|