Sirkulære RNA-er (circRNA-er) ble først oppdaget som ikke-kodende RNA-er i 1979; det var først i 2015 at transkriberte circRNA-er ble funnet i Drosophila, noe som førte til studiet av in vitro circRNA-er for terapeutiske og forebyggende formål.
circRNA er selvekspanderende og har derfor ikke en konvensjonell struktur som en 5' cap eller 3' polyA hale. Denne strukturen gjør dem mer stabile og motstandsdyktige mot eksonukleaser som RNase R.
Strukturelementer av sirkulært RNA (circRNA)
Template-DNA for circRNA-syntese inkluderer vanligvis internt ribosominngangssted (IRES), åpen leseramme (ORF) og andre som er kritiske for in vitro-sirkulasjon. For eksempel designet vi et plasmid som in vitro transcript (IVT) mal, som består av homologiarmer, 3' intron, 3' exon, IRES, ORF, 5' exon og 5' intron, for å fremstille circRNA ved selvspleising metoder.
Internal Ribosome Entry Site (IRES) utfører viktige roller i oversettelsen av cirRNA. Encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, humant rhinovirus B3 (HRV-B3) IRES og andre IRES har blitt ofte brukt for oversettelse av vitro-syntesen av cirRNAer
In vivo-syklisering av circRNA lineære forløpere gir et viktig skritt i circRNA-syntese, vanligvis gjennom kjemiske, enzymatiske og ribosommedierte selvreplikasjonsveier. Kjent som en milepæl på feltet, den kjemiske tilnærmingen for circRNA-produksjon, oppsto i 1988, brukes ikke lenger i dag på grunn av høye kostnader, lave utbytte, høye antall biprodukter og det faktum at den kun er egnet for sykling. RNA opp til 70 nukleotider lange.
Enzymatiske metoder for sykling av RNA er basert på bakteriofag T4-enzymer eller ribozymer som T4 DNA-ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA-ligase 1 (T4 Rnl 1) og T4 RNA-ligase 2 (T4 Rnl 2). For å danne sirkulært RNA av T4-bakteriofagenzymer, må nukleosidmonofosfater være lokalisert i 5'-enden og konjugert til OH-gruppen i 3'-enden av RNA. Fordi nukleosidtrifosfater tilsettes under reaksjonen, inneholder IVT RNA guanosintrifosfat (GTP) i 5'-enden.
Ribozymer er RNA-sekvenser som fremmer selvspleising ved å konvertere lineære RNA-molekyler til circRNA uten behov for ytterligere enzymer. Selvmonteringsprosessen involverer to påfølgende transesterifiseringsreaksjoner på spesifikke steder for å sikre at de ønskede cirRNA-produktene dannes. Gruppe I-intron-selvspleisingsmetoden, også kjent som PIE (intron and exon-innkapsling), som tillater produksjon av cirRNA-er lengre enn 5 kb, har blitt grundig studert og har vist seg nyttig.
Anvendelse av sirkulært RNA (circRNA)
CircRNA-vaksiner
Som lineære mRNA-er kan circRNA-er omdannes til visse proteiner i målceller og indusere den robuste humorale og cellulære immuniteten. Nylig er det noen forskerteam som har utviklet circRNA-vaksiner for å forhindre COVID-19. Resultatene deres har ikke bare hatt fordelene med lineære mRNA-vaksiner, men har også skrytt av en bedre stabilitet og lengre varighet av proteinekspresjon enn lineær mRNA. Derfor kan circRNA-vaksiner indusere tilstrekkelig immunrespons selv ved lave doser.
I tillegg tror noen forskere at circRNA-vaksiner, som neste generasjons mRNA, kan bli effektive verktøy i fremtiden for å bekjempe vanlige virus/bakteriesykdommer og store nye infeksjonssykdommer, samt for behandling av kreft og andre sykdommer.
CircRNA i CAR / TCR-T terapi
Som en pioner innen sirkulært RNA har ORNA utviklet in situ kimær antigenreseptor (CAR) terapi for in situ terapi som bruker ORN-101, et LNP-innkapslet sirkulært RNA, for å modulere immunceller hos pasienter. ORN-101 presenterer høyt uttrykk for CAR drevet av et optimert IRES-element. I dyremodeller ble ORN-101 vist å indusere tumorundertrykkelse og ødeleggelse, noe som tyder på at ORN-101-baserte antikreftterapier kan forstyrre konvensjonell CAR-T-celleterapi.
I tillegg har Zhang et al. evaluerte levedyktigheten og den terapeutiske effekten av circRNAs i antigenspesifikke T-cellereseptor (TCR)-T-terapier. De designet et circRNA som koder for pp65-TCR-T rettet mot pp65-epitopen til cytomegalovirus (CMV). I tillegg er det vist at pp65-TCR kommer til uttrykk på primære T-celler i over 7 dager. I tillegg drepte circRNA-pp65-TCR-T-celler spesifikt og konsekvent pp65- og HLA-uttrykkende tumorceller og forlenget overlevelsestiden til mus betydelig.
Det ble også vist at celler transfektert med pp65 circRNA viste bedre immunrespons sammenlignet med lineært mRNA.
Yaohais Bio-Pharma One-Stop CRDMO-løsning for langkodende RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NEI
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
